PCBs和PAHs脅迫下大豆和黃瓜種子萌發及幼苗生長特征

劉浩然，王俊霞,2,4,*，沈曉芳，顧海東，張占恩,2,4

1. 蘇州科技大學環境科學與工程學院，蘇州 215009 2. 蘇州科技大學，江蘇省環境科學與工程重點實驗室，蘇州 215009 3. 新加坡國立大學蘇州研究院，蘇州 215024 4. 蘇州科技大學，水處理技術與材料協同創新中心，蘇州 215009

多氯聯苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)和多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon, PAHs)是2類常見的持久性有機污染物(POPs)，因其具有持久性和生物富集性，已在地表水、土壤、地下水、植物和動物體內廣泛檢出[1-3]。相關毒理學數據表明，它們具有神經毒性、生殖毒性、內分泌干擾作用甚至致癌作用。Menzel等[4]發現PCB-52對以線蟲為代表的動物有明顯的毒害作用，會引起線蟲的基因響應。Wang等[5]檢測了中國東海大黃魚體內的PCBs和PAHs濃度，發現其已達人體致癌濃度，不僅對魚類產生嚴重危害，且通過食物鏈的傳遞和富集最終威脅人體健康。受到PCBs和PAHs污染的地區，人類罹患癌癥的概率和死亡率數倍甚至數十倍高于未被污染的地區[6]。Zeneli等[7]的研究表明，煉油廠排放的總石油烴(total petroleum hydrocarbons, TPH)和PAHs混合物對植物有明顯毒害作用，并且植物在混合物暴露時對PAHs的吸收率比單一PAHs暴露時更高。羅春燕等[8]的研究表明，當膠體富勒烯和菲共存時，對植物的毒性增高，當納米富勒烯和菲共存時，對植物的毒性降低。目前，國內外尚缺乏PCBs和PAHs復合污染脅迫下植物的生長情況以及植物對復合污染物的吸收和富集特征的研究。

黃瓜(CucumissativusL.)是我國重要的蔬菜作物之一，屬于葫蘆科一年生攀援草本植物；大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)是我國重要糧食作物之一，屬于豆科一年生草本農作物，不同植物種類對PCBs和PAHs的脅迫響應存在一定差異。種子萌發及幼苗生長是植物對環境脅迫最敏感的時期。通過種子萌發實驗，在2,4,4’-三氯聯苯(PCB28)和菲單一脅迫和復合脅迫下，考察大豆和黃瓜種子發芽率、幼苗生長狀況和光合作用能力，以及PCB28和菲在植物體內的吸收和分布特征，為PCBs和PAHs復合污染的植物毒性研究提供了基礎數據，為后續植物修復技術研究提供了方向。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

黃瓜(滬雜3號)和毛豆(滬寧96-10)種子購于上海市農業科學院設施園藝研究所。篩選大小均勻、顆粒飽滿的種子用質量分數為5%的NaClO消毒15 min，用清水洗凈后待用。

1.2 種子萌發實驗

參照田月娥等[9]的方法完成種子萌發實驗。將種子浸泡在不同濃度單一PCB28、菲以及復合PCB28+菲處理組中24 h，之后用蒸餾水洗凈，置于鋪有3層濾紙的培養皿(φ=10 cm)中，每個培養皿放20粒種子，對照組以蒸餾水浸種，將培養皿放到人工氣候箱中培養，光照強度設定為3 000 lx，光暗周期為12 h/12 h，晝夜溫度為28 ℃/18 ℃，相對濕度為70%～75%。

種子萌發期間，每天觀察并記錄發芽情況。發芽標準為胚根長度達到種子長度的1/2，發芽后測定相對發芽率和發芽勢(5 d)，萌發實驗進行至無新種子萌發為止。

參考李葉等[10]的研究，設計PCB28的低、中、高濃度組(0.01、0.1和1.0 mg·L-1)，分別標記為1-T-1、1-T-2和1-T-3，根據Iqbal等[11]的研究，設計菲的低、中、高濃度組(0.01、0.1和1.0 mg·L-1)，分別標記為2-T-1、2-T-2和2-T-3，同時設置對照組，標記為CK1T。為考察PCB28和菲的聯合毒性，將0.1 mg·L-1PCB28分別與低、中、高濃度菲(0.01、0.1、1.0 mg·L-1)組成混合暴露組，分別標記為3-T-1、3-T-2和3-T-3。暴露0 d時植物葉片的葉綠素熒光參數作為對照組，標記為CK2T。

1.3 測定方法

1.3.1 萌發指標

發芽勢(Gv)=n/N×100%，其中，n為規定時間內(5 d)發芽種子數，N為種子總數。

發芽率(Gp)=n1/N1×100%，其中，n1為無新種子萌發時的最終發芽種子數，N1為無新種子萌發時的最終種子總數。

為排除培養條件如溫度、濕度等自然條件對種子發芽的影響，計算相對發芽率，相對發芽率(%)=處理組發芽率/對照組發芽率×100%。

1.3.2 植物幼苗生長指標

根據鄧桂榮等[12]的方法進行幼苗培養，培養0、2、4、6和8 d后測定植物幼苗的根長、株高和濕重，所有指標均重復3次，取平均值。使用處理組根長(或株高、濕重)減去對照組根長(或株高、濕重)計算出差值，然后計算出差值與對照組根長(或株高、濕重)的比值，得出生長減少率(%)。

1.3.3 葉綠素熒光特性

根據周玉霞等[13]的方法，在暴露的第5天，將黃瓜和大豆幼苗第3片真葉暗處理20 min后，利用葉綠素熒光測試儀(Yaxin-1161G型，北京雅欣理儀科技有限公司)測試其光合作用參數，設置光化強度2 500 lx，持續時間5 s，獲得葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP曲線)以及最大光化學效率(Fv/Fm)和潛在光化學效率(Fv/Fo)等葉綠素熒光參數[14]，與暴露0 d的空白對照組(CK2T)數據進行對比。

1.3.4 植物體內PCB28和菲的含量

參考文獻[15-16]的方法，利用德國Bruker公司的456 GC-SCION TQ型氣相色譜-串聯質譜聯用儀(GC-MS/MS)測定植物根、莖和葉中PCB28和菲的含量。

1.4 數據分析與計算

用Origin8.0軟件處理數據，計算半數致死濃度(LC50)和半數效應濃度(EC50)并作圖，用SPSS統計軟件進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 種子的發芽率

如表1所示，PCB28的中、高濃度組、菲高濃度組以及PCB28+高濃度菲復合暴露組中大豆種子的相對發芽率分別為80%、60%、80%和80%，其余濃度組中大豆種子的相對發芽率為90%和100%。PCB28高濃度組和菲高濃度組中大豆種子的發芽勢分別為13.33%和20%，均≤20%，其余處理組中大豆種子的發芽勢均>20%。對黃瓜種子而言，PCB28高濃度組、菲高濃度組和PCB28+高濃度菲復合暴露組中相對發芽率為60%、70%和70%，均<80%，PCB28高濃度組、菲高濃度組中發芽勢均<30%。所有的高濃度組中2類植物種子的相對發芽率和發芽勢與對照組之間均存在顯著性差異(P<0.05)。這表明，高濃度PCB28和菲對種子萌發產生了明顯的毒害作用。如表2所示，復合暴露下大豆的LC50明顯大于單一暴露，菲暴露下黃瓜的LC50明顯大于PCB28和復合暴露。

表1 2,4,4’-三氯聯苯(PCB28)和菲暴露對大豆和黃瓜種子發芽的影響Table 1 Effects of 2,4,4’-trichlorobiphenyl (PCB28) and phenanthrene on the germination of soya bean and cucumber seeds

表2 大豆和黃瓜種子死亡率與濃度對數的曲線方程和半數致死濃度(LC50)Table 2 Logarithmic concentration curve equation and median lethal concentration (LC50) for mortality of soya bean and cucumber seeds

2.2 植物幼苗生長特征

2.2.1 大豆幼苗生長量

大豆幼苗根長生長減少率如圖1(a)所示，高濃度PCB28組，從第2天到第8天，大豆幼苗根長生長減少率從50%變化至90%，并維持在90%左右；中濃度PCB28組，第4天之前生長減少率超過75%，隨后下降，第8天根長生長減少率為負，這表明中濃度PCB28在暴露后期可促進幼苗根生長；低、中濃度菲暴露組，在第8天時，大豆幼苗根長生長減少率>90%，高濃度菲暴露組在第4天及之后大豆幼苗根長生長減少率維持在95%左右；PCB28+低、中濃度菲復合暴露組在4 d后根長生長減少率為70%以上。

圖1 PCB28和菲暴露對大豆幼苗根長和株高的影響Fig. 1 Effects of PCB28 and phenanthrene on the root length and stem length of soya bean seedlings

大豆幼苗株高生長減少率如圖1(b)所示，PCB28和菲單獨暴露下，第2天中濃度組大豆幼苗株高生長減少率最高，在第4天及之后高濃度組生長減少率最高，如高濃度菲暴露組在4、6和8 d時生長減少率分別為95%、92%和98%。低濃度菲暴露組在第6天時生長減少率為-30%，到第8天時為50%以上，這說明低濃度菲長期暴露也會影響植物幼苗的株高。

大豆根長生長減少率的EC50如表3所示，菲和復合暴露的EC50都大于PCB28暴露，說明PCB28對大豆根長的抑制作用更明顯。

圖2 PCB28和菲暴露對大豆幼苗濕重的影響Fig. 2 Effects of PCB28 and phenanthrene on the wet weight of soya bean seedlings

表3 大豆根長和株高生長減少率與濃度對數的曲線方程和半數效應濃度(EC50)Table 3 Logarithmic concentration curve equation and median effect concentration (EC50) for the reduction rate of root and stem length of soya bean

大豆幼苗濕重生長減少率如圖2所示，高濃度PCB28組在第2天幼苗濕重生長減少率>50%，高濃度菲暴露組在第4天時大豆幼苗濕重生長減少率達99%，PCB28+高濃度菲復合暴露組在第6天以后生長減少率維持在90%以上。PCB28和菲單一及復合暴露的中濃度組，大豆幼苗濕重生長減少率隨暴露時間沒有統一的變化規律。PCB28低濃度組、菲低濃度組和PCB28+低濃度菲復合暴露組，第6天時大豆幼苗濕重生長減少率分別為-8%、-35%和-33%，這說明低濃度PCB28和菲暴露有助于大豆幼苗濕重的增加。

大豆幼苗濕重生長減少率的EC50如表4所示，菲和復合暴露的EC50都小于PCB28暴露的，說明菲和PCB28復合暴露對大豆幼苗濕重的抑制作用更明顯。

2.2.2 黃瓜幼苗生長量

黃瓜幼苗根長生長減少率如圖3(a)所示，PCB28高濃度組、菲高濃度組和PCB28+高濃度菲復合暴露組，第2天時黃瓜幼苗根長生長減少率最高，分別為98%、92%和95%。PCB28和菲單一及復合暴露的中濃度組，黃瓜幼苗根長生長減少率大體呈現“N”字型變化趨勢，第8天時，除了菲中濃度組，其他中濃度組均在70%以上。PCB28和菲單一及復合暴露低濃度組，第6天時黃瓜幼苗根長生長減少率均為負值，這表明PCB28和菲低濃度暴露可促進黃瓜幼苗根的生長。

黃瓜幼苗株高生長減少率如圖3(b)所示，PCB28和菲單一及復合暴露高濃度組，黃瓜幼苗株高生長減少率維持在50%以上。除了菲中濃度組，其余中濃度組黃瓜株高生長減少率均>0。菲低濃度組第8天時株高生長減少率為-40%，PCB28低濃度組和PCB28+低濃度菲復合暴露組，第4天時株高生長減少率為-5%和-9%。

圖3 PCB28和菲暴露對黃瓜幼苗根長和株高的影響Fig. 3 Effects of PCB28 and phenanthrene on the root length and stem length of cucumber seedlings

表4 大豆濕重生長減少率與濃度對數的曲線方程和EC50Table 4 Logarithmic concentration curve equation and EC50 for the reduction rate of wet weight of soya bean

黃瓜根長和株高生長減少率的EC50如表5所示，PCB28暴露的EC50明顯小于菲和復合暴露的，說明PCB28對黃瓜根長和株高的抑制作用更明顯。

表5 黃瓜根長和株高生長減少率與濃度對數的曲線方程和EC50Table 5 Logarithmic concentration curve equation and EC50 for the reduction rate of root and stem length of cucumber

黃瓜幼苗濕重生長減少率如圖4所示，PCB28和菲單一及復合暴露的中、高濃度組中，濕重生長減少率在65%～98%之間。這說明中、高濃度暴露會降低黃瓜幼苗的濕重。

圖4 PCB28和菲暴露對黃瓜幼苗濕重的影響Fig. 4 Effects of PCB28 and phenanthrene on the wet weight of cucumber seedlings

黃瓜幼苗濕重生長減少率的EC50如表6所示，菲暴露的EC50大于PCB28和復合暴露的，說明菲對黃瓜幼苗濕重的抑制作用更小。

2.3 植物葉片葉綠素熒光參數

幼苗葉片Fv/Fm如圖5(a)所示，Fv/Fm從大到小順序為低濃度組>中濃度組>高濃度組。高濃度組大豆幼苗葉片的Fv/Fm最低，約為0.26～0.41，與對照組(0.73)比較，有顯著性差異(P<0.01)。中濃度組大豆幼苗葉片的Fv/Fm為0.45～0.63，與對照組比較，存在顯著性差異(P<0.05)。對黃瓜幼苗葉片而言，PCB28高濃度組和PCB28+高濃度菲復合暴露組的Fv/Fm分別為0.02和0.21，與對照組比較，存在顯著性差異(P<0.01)，但菲暴露組的Fv/Fm為0.6～0.75，與對照組(0.62)比較，差異不顯著。所有低、中濃度組黃瓜幼苗Fv/Fm與大豆幼苗的基本一致。

幼苗葉片的Fv/Fo如圖5(b)所示，經PCB28和菲單一暴露5 d后，2類植物幼苗葉片Fv/Fo較對照組明顯下降，隨著暴露濃度增大，Fv/Fo下降更明顯。菲低、高濃度組大豆幼苗葉片的Fv/Fo分別為2.69和0.36，PCB28低、高濃度組黃瓜幼苗葉片的Fv/Fo分別為2.56和0.02。這說明，PCB28和菲脅迫對2類幼苗的生長產生抑制作用，影響光系統Ⅱ的電子傳遞，導致Fv/Fo降低。

圖5 大豆和黃瓜葉片最大光化學效率(Fv/Fm)和潛在光化學效率(Fv/Fo)注：CK2T表示暴露0 d時植物葉片的葉綠素熒光參數空白對照組。Fig. 5 Maximum photochemical efficiency (Fv/Fm) and potential photochemical efficiency (Fv/Fo) of leaves of soya bean and cucumberNote: CK2T represents blank control group of chlorophyll fluorescence parameters of plant leaves on 0 d.

表6 黃瓜濕重生長減少率與濃度對數的曲線方程和EC50Table 6 Logarithmic concentration curve equation and EC50 for the reduction rate of wet weight of cucumber

2.4 植物幼苗體內污染物的含量

如表7所示，PCB28中、高濃度組中，在大豆和黃瓜各部位中均未檢出PCB28。低濃度PCB28脅迫下，PCB28在大豆和黃瓜各部位的含量均呈現出根>莖>葉。在所有菲暴露組中，菲在大豆和黃瓜各部位的含量也都呈現出根>莖>葉。在復合暴露下，中、高濃度組中，大豆各部位對菲的吸收呈現出根>莖>葉。在復合暴露下，黃瓜各部位對菲的吸收同樣呈現出根>莖>葉，且中、高濃度組黃瓜根部和莖部對菲的吸收遠大于葉對菲的吸收。

表7 大豆和黃瓜幼苗各部位中PCB28和菲含量Table 7 The PCB28 and phenanthrene content of each part of soya bean and cucumber seedlings (μg·g-1)

3 討論(Discussion)

3.1 對種子萌發的影響

Drwal等[17]的研究表明，PAHs可以直接導致細胞死亡。同時，污染物可以通過影響酶活性而影響種子萌發[18]。根據本研究結果可知，PCBs和PAHs對植物種子萌發有明顯抑制作用。PCB28的中、高濃度組、菲高濃度組以及PCB28+高濃度菲復合暴露組中，大豆種子的相對發芽率較對照組有顯著性降低(P<0.05)。PCB28高濃度組、菲高濃度組以及PCB28+高濃度菲復合暴露組中，大豆種子的發芽勢與對照組比較有顯著性降低(P<0.05)。PCB28和菲單一及復合暴露低濃度組的大豆種子發芽勢低于對照組(P<0.05)。PCB28高濃度組、菲高濃度組以及PCB28+高濃度菲復合暴露組中，黃瓜種子的相對發芽率顯著低于對照組(P<0.05)，所有PCB28和菲單一及復合暴露組的發芽勢均未大于對照組。綜合分析結果可知，PCB28和菲對種子萌發全程以及萌發前期都存在影響。這與陳方圓等[19]的研究結果略有不同，其研究結果表明，黃瓜種子萌發前期受污染物影響較小。這可能與暴露濃度及相關實驗條件不同有關。

3.2 對植物幼苗生長的影響

郭敏等[20]的研究表明，在受到有毒污染物脅迫時，植物會產生氧化應激反應，直接影響到根部對營養物質的吸收和細胞的生長。根據劉靜等[21]的研究，當菲的濃度較低時，可以促進植物幼苗地上部和地下部的生長，同時菲對植物各部分影響存在差別[22]。這與本研究的結果類似，低濃度菲暴露組中幼苗生長要優于低濃度PCB28組和空白對照組。羅春燕等[8]的研究表明，復合污染脅迫下，其余污染物會減少植物幼苗對菲的吸收，且復合污染暴露組中植物幼苗所受影響小于單一菲暴露組。本研究表明，高濃度PCB28和菲單一暴露對植物生長抑制作用明顯，但中、低濃度PCB28和菲單一暴露時，有促進植物生長的情況發生。復合暴露組對黃瓜幼苗株高的影響小于單一暴露組，這表明復合暴露組可能存在拮抗作用。

3.3 對植物葉片熒光參數的影響

PCB28和菲單一及復合暴露的所有高濃度組的Fv/Fm和Fv/Fo顯著低于中、低濃度組。閆帥等[23]的研究表明，高濃度污染物脅迫下，植物幼苗體內的活性氧含量會增加，影響光合電子傳遞，損傷光合系統，直接影響到植物的光化學效率，導致Fv/Fm和Fv/Fo降低。

3.4 植物體內各部位污染物的含量

微生物(真菌)可以促進植物對PCBs的吸收和降解[24]，但高濃度的PCBs會直接威脅到植物根系和微生物的生長，從而減少植物對PCBs的吸收和分解[25]。

研究表明，生物有適應環境逆境的調控機制，植物可以通過降低新陳代謝應對外界威脅[26-27]。根據本研究結果可知，中、高濃度的PCB28暴露組中，大豆和黃瓜幼苗體內未檢測到PCB28，推測大豆和黃瓜幼苗通過減少對PCB28的吸收來對抗脅迫，但似乎2種幼苗體內缺少對菲脅迫的響應機制，中、高菲濃度組中對菲均有吸收。

污染物在植物各器官內的富集具有明顯的規律性，且不同植物對污染物的富集原理存在差異，各器官間富集規律不同[28-29]。大豆和黃瓜幼苗各部位內PCB28和菲的含量呈現出根部>莖部>葉部，規律性明顯，但黃瓜幼苗內PCB28的分布較大豆幼苗均勻，且復合脅迫下大豆幼苗各部位對污染物的吸收較黃瓜幼苗均勻，這與植物種類或污染物間的拮抗作用有一定關系。