霉菌毒素單獨或聯合暴露對睪丸間質細胞毒性作用研究進展

凌阿茹，孫玲偉，孫詩謠，戴建軍，張德福，楊俊花，趙志輝,#

1. 上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403 2. 上海海洋大學食品學院，上海 201306 3. 上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106

霉菌毒素(mycotoxins)，是一類由霉菌在生長過程中產生的有毒次級代謝物，嚴重危害人類和動物健康[1]。霉菌毒素在飼料或玉米、小麥和高粱等飼料原料及其他糧油食品中廣泛存在，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)、嘔吐毒素(deoxynivalenol, DON)、T-2毒素和玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)等霉菌毒素最為常見，通常還伴有其代謝產物的協同污染[2]。霉菌毒素污染具有多樣性和廣泛性，其不僅在各類飼料或飼料原料中存在，還能在動物體內殘留[3]，對動物或人類產生一定危害，包括免疫毒性、神經毒性、肝臟毒性、腎臟毒性、腸毒性以及生殖毒性等[4]。流行病學研究表明，近年來中國男性精液質量呈下降趨勢，男性不育癥發病率顯著提高，這可能與環境中的霉菌毒素等內分泌干擾污染物密切相關[5-6]。

睪丸間質細胞(Leydig cells, LCs)又稱睪丸間隙細胞，是人和動物體內合成與分泌睪酮的主要細胞，分布在生精小管間的疏松結締組織之中，其數量約占睪丸細胞總量的2%～4%[7]。LCs對維持機體生殖系統的穩定具有重要意義，其對機體的影響是通過睪酮合成和分泌來實現的，包括刺激雄性動物內(外)生殖器發育成熟和維持其生理機能、促進精子生成和成熟以及作用于中樞神經系統調控雄性動物性行為等[8-9]。而且研究表明，LCs等生殖細胞易受霉菌毒素侵害影響雄性生殖功能[10]。因此，LCs能夠作為探究霉菌毒素引起生殖毒性機制的良好體外模型。

目前，關于霉菌毒素對LCs的毒性作用研究報道較少，且多集中于ZEA和T-2等單一毒素對LCs的毒性作用機制研究[11-15]。因此，本文就霉菌毒素對LCs的毒性作用研究進展進行總結，以此為霉菌毒素對LCs的毒性作用機制研究提供思路和理論支持。

1 ZEA對LCs的毒性作用研究(Study on the toxicity of ZEA to LCs)

ZEA是由鐮刀菌產生的一種非甾體雌激素類霉菌毒素，是玉米、大麥、小麥和高粱等谷物及其副產品中污染最普遍的毒素之一[16]。ZEA能夠引起雄性動物發生生殖障礙，降低公豬睪酮含量和精子質量，破壞精細胞染色體結構和精子活力[17]。ZEA的細胞毒性通常表現為誘發細胞凋亡/自噬，抑制蛋白質、DNA或RNA的合成，引起氧化應激和線粒體損傷等[18]。因此，本文從以下幾個方面探討其對LCs的毒性作用機制。

1.1 誘導細胞發生凋亡/自噬

細胞凋亡和自噬對維持細胞內環境穩定和動態平衡等生物功能十分重要。有研究表明，在一定環境下自噬與凋亡之間存在復雜的聯系：自噬是凋亡的前提、自噬抑制凋亡的發生或者自噬與凋亡共同引起細胞死亡[19]。甄建偉[11]發現不同濃度的ZEA均能誘導豬LCs發生凋亡，Bax與Bcl-2蛋白表達量比值(Bax/Bcl-2)也呈現先升高后下降的趨勢。這說明，低劑量ZEA暴露時主要誘導LCs發生凋亡；在高濃度時則由誘導凋亡轉變為致壞死作用。Yang等[20]也發現ZEA能夠通過內質網應激、半胱天冬酶依賴性/非依賴性途徑等多種途徑提高山羊LCs凋亡和自噬水平，進而誘發細胞死亡。Wang等[21]將大鼠LCs暴露于ZEA后，發現其不僅通過上調Bax的表達促進細胞色素c釋放到細胞質中觸發細胞凋亡增加，還上調了LC3-II和Bcl-1的表達，表明ZEA誘導細胞發生了高水平的自噬。王亞軍[13]進一步使用自噬抑制劑(氯喹)和自噬促進劑(雷帕霉素)對經ZEA染毒的LCs進行處理，發現激活自噬能夠降低LCs的凋亡率，抑制自噬能夠提高細胞的凋亡率，說明ZEA誘導LCs凋亡的過程中，自噬可能起保護作用?？梢?，ZEA能夠通過誘導LCs發生凋亡/自噬，產生細胞毒性。

1.2 引起DNA損傷

DNA作為細胞內具有遺傳信息傳遞作用的一種重要生物大分子，對細胞的生長繁殖起著重要作用。當DNA合成受阻或DNA鏈斷裂時會間接導致細胞產生氧化損傷，影響細胞有絲分裂，改變細胞周期進而誘導細胞發生凋亡等[22]。如前所述，甄建偉[11]不僅發現ZEA會引起豬LCs的凋亡，還通過彗星試驗觀察到：低劑量ZEA處理會提高拖尾率，但并不顯著。隨著ZEA染毒劑量增加，細胞DNA斷裂顯著增強，呈現明顯的劑量-效應關系。黃沁怡[23]對小鼠LCs進行了ZEA暴露試驗，也發現低濃度ZEA能夠引起細胞DNA斷裂，而且隨著劑量增加斷裂變得越來越顯著，同時還提高了原癌基因的表達，降低了抑癌基因的表達。由此可見，ZEA不僅能夠引起LCs的DNA損傷，誘導細胞凋亡/自噬，還能夠破壞基因組的穩定性，促進正常細胞向腫瘤細胞的轉化。

1.3 線粒體損傷

線粒體位于細胞核外，其不僅是細胞產生能量的主要場所，還能夠攜帶遺傳信息，參與細胞的生長分裂、代謝衰老等過程，具有重要意義[24]。鄭王龍等[12]對暴露于ZEA后的豬LCs進行研究發現，細胞的線粒體膜電位下降，且線粒體出現空泡化和內質網斷裂等結構性改變，從而進一步引起細胞不可逆性凋亡。Yang等[20]的研究也證明ZEA會通過線粒體內質網應激途徑誘導山羊LCs中的細胞凋亡及死亡。Li等[25]使用基于蛋白質組學的同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)方法鑒定低濃度ZEA對小鼠睪丸間質腫瘤細胞毒性作用的分子機制，結果顯示，ZEA通過促進脂肪酸攝取、β-氧化及過度的氧化應激來增加能量的產生引起線粒體損傷，并抑制類固醇的生成和酯化。線粒體是參與LCs睪酮合成的主要細胞器之一，所以線粒體損傷不僅與細胞凋亡關系密切，還將直接影響睪酮合成分泌[26]。

1.4 抑制睪酮的合成與分泌

睪酮在雄性動物精子生成、維持雄性動物第二性特征以及影響受精成功率等方面均具有重要作用[27]。Liu等[28]使用低濃度ZEA對小鼠LCs進行染毒處理，發現ZEA能夠直接抑制LCs合成分泌睪酮，且抑制作用呈時間依賴性；進一步試驗發現，ZEA能夠顯著降低線粒體膜電位以及睪酮合成相關的17β-羥甾脫氫酶、細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶和細胞色素P450-17α-羥化酶的mRNA表達水平，增加類固醇合成快速調節蛋白和3β-羥甾脫氫酶的mRNA表達水平，顯著升高細胞內環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平，顯著抑制Nur77的蛋白表達，這表明ZEA通過雌激素受體信號傳導(cAMP途徑)和孤生核受體Nur77表達共同干擾抑制小鼠LCs睪酮的生物合成。董雙等[29]通過腹腔注射對雄性小鼠進行ZEA染毒，體內實驗結果表明，隨著染毒劑量增加，血清中睪酮濃度顯著下降，這與Liu等[28]的體外實驗結果一致，說明ZEA能夠引起雄性小鼠生殖系統的損傷。Zhou等[30]分別對大鼠和大鼠LCs進行了體內和體外ZEA暴露實驗，也呈現相同結果。因此，體內和細胞試驗均證明ZEA會破壞LCs的增殖發育，并降低睪酮生成。

2 T-2毒素對LCs的毒性作用研究(Study on the toxicity of T-2 toxin to LCs)

T-2毒素主要是由寄居在多種農作物上的擬枝孢鐮刀菌和三線鐮刀菌等產生，是單端孢霉烯族A類化合物中毒性最強的霉菌毒素[31]。T2毒素通常表現為免疫毒性、神經毒性、腸道和肝臟毒性等[32]。然而，目前關于T-2毒素對LCs等生殖細胞的毒性作用機制的研究報道較少。楊建英等[14]使用T-2毒素對原代小鼠LCs染毒，結果顯示，隨著染毒劑量增加，細胞活力呈劑量依賴性降低；不僅如此，與對照組相比，毒素處理組LCs睪酮分泌量也顯著降低，同樣呈現劑量-效應關系。這說明，T-2毒素能夠抑制LCs的活力，破壞其睪酮分泌功能。隨后Yang等[15]進一步研究發現，T-2毒素使與睪酮合成密切相關的3β-羥基類固醇脫氫酶-1、細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶和類固醇合成快速調節蛋白的mRNA表達受到抑制，同時降低相關酶活性，從而降低睪酮合成和分泌。Wu等[33]的研究表明，T-2毒素對小鼠LCs的毒性作用表現為抑制細胞增殖，T-2毒素能夠降低細胞內超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，提高過氧化氫酶活性以及活性氧和丙二醛的含量；降低線粒體膜電位的同時降低線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ～Ⅴ含量；還增加了應激誘導蛋白ASK、p38和JNK的表達，上調了CypD、Bax和Bak蛋白表達，下調了Bcl-2、Bcl-xl和cyt c蛋白表達，從而誘導細胞凋亡。由此可見，T-2毒素是通過氧化應激誘導細胞凋亡的。Zhang等[34]研究發現，T-2毒素能夠引起小鼠LCs發生氧化應激而產生細胞毒性。由于DNA對有毒物質產生的活性氧敏感，所以氧化應激能夠引起DNA損傷，最終可能導致細胞發生凋亡[35]。這與Yuan等[36]的研究結果一致，其結果表明，T-2毒素能夠誘導小鼠LCs發生氧化應激而引發DNA損傷。已有多項研究表明，T-2毒素能夠誘導雞肝細胞[37]和人正常肝細胞(L02細胞)[38]等的自噬，但目前除Yang等[39]報道T-2毒素能夠誘導小鼠原代LCs發生高水平的自噬外，未見有其他關于T-2毒素引起LCs發生自噬的報道。

3 其他霉菌毒素對LCs的毒性作用研究(Study on the toxicity of other mycotoxins to LCs)

霉菌毒素種類繁多，地域分布廣泛，污染基質多樣，極易對人和動物造成多種傷害[40]。除上述提到的ZEA和T-2毒素對LCs的毒性作用研究外，Krisztina等[41]發現OTA能夠影響公豬精子生成和降低精液質量，但未闡明毒素和生殖細胞之間的具體作用關系。在LCs中，雌激素等類固醇生成主要由促黃體生成激素(luteinizing hormone, LH)調節[42]。Kalayou等[43]發現當未經LH處理的原代仔豬LCs暴露于10 μmol·L-1的恩鐮孢菌素B(enniatin B, ENN B)時，雌二醇和睪酮分泌水平顯著下降；而經LH處理的原代仔豬LCs暴露于高濃度(>10 μmol·L-1)的ENN B時，雌二醇和睪酮分泌水平同樣顯著降低。這說明，經ENN B處理的LCs中類固醇水平的降低與細胞毒性相關，但不是特定的拮抗作用。

除了對單一毒素的研究，Eze等[44]分別研究了AFB1、DON、ZEA、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol,β-ZOL)和OTA共6種霉菌毒素單一和二元聯合對小鼠LCs活力的影響，結果顯示：在單一劑量刺激下，DON對小鼠LCs毒性最強，其次是α-ZOL、OTA、ZEA、β-ZOL和AFB1；二元毒素聯合處理時，不同濃度聯合處理呈現的聯合作用類型(拮抗、協同和疊加作用)不同，但未闡述具體作用機制。Savard等[45]的研究表明，DON和ZEA單獨或聯合處理均會直接影響小鼠LCs合成和分泌生殖激素，且該細胞對DON更敏感，當兩者聯合使用時對生殖激素的合成不存在協同作用。

4 總結與展望(Summary and prospect)

筆者總結分析了常見霉菌毒素對LCs毒性作用的研究結果，發現關于霉菌毒素對LCs的毒性作用機制研究目前主要集中在ZEA和T-2毒素單獨暴露對LCs的毒性作用研究上。事實上，霉菌毒素往往構成多種毒素協同污染?，F有的研究中，僅有少量涉及部分常見霉菌毒素對LCs的二元聯合作用，且未闡明具體機制。因此，除了需要加強其他常見毒素單一暴露對LCs的毒性作用研究外，還應考慮到多種毒素共同暴露對LCs聯合毒性的研究，以期為控制和緩解霉菌毒素暴露對男性生殖健康的危害提供一定的理論基礎和研究思路。