膀胱癌甲基化相關蛋白UHRF1的表達及臨床意義

林謙 章慶華 付承林 夏青青 王瓊英

泛素樣含PHD和環指域蛋白1（UHRF1）是新發現的一種與細胞生長有關的核蛋白基因，屬UHRF家族成員之一，是首先被克隆作為一種與細胞生長有關的核蛋白基因［1］。其是一個重要的表觀遺傳調節因子，參與并維持DNA的甲基化。近年來，發現其在靜止的細胞中表達較低，而在增殖的腫瘤細胞中表達明顯增加，是一個致癌基因［2］，與多種腫瘤的發生、發展及預后有一定的關聯。本研究采用免疫熒光的方法，測定膀胱癌組織及癌旁正常組織中UHRF1的表達情況，并探討其與膀胱癌臨床病理特征之間的關系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料選取2016年1月至2018年6月本院膀胱癌手術患者82例（經尿道膀胱腫瘤電切62例、膀胱部分切除2例、根治性膀胱全切18例），所有患者均為初次手術，術前未接受任何局部及全身放化療。男62例，女20例；年齡39~84歲，平均年齡63.2歲。標本經病理確診為膀胱癌，其中尿路上皮癌77例，非尿路上皮癌5例（鱗癌3例，腺癌2例）。同期取距離腫瘤邊緣至少>2cm癌旁正常膀胱組織56個病例樣本作為對照。標本均在手術切除后30min內完成采集。分別記錄年齡、性別、組織學類型、組織學分級、臨床分期、是否肌層浸潤。

1.2 主要實驗試劑鼠抗人UHRF1抗體，abcam公司，貨號ab57083，規格100μg，購自匠萊生物科技（上海）有限公司。

1.3 免疫熒光方法病理標本常規石蠟切片，水化后置于二甲苯（I）1h，二甲苯（II）1h，二甲苯：酒精1∶110min，100%酒 精（I）1min，100%酒 精（II）1min，90%酒精1min，80%酒精1min，70%酒精1.5min，50%酒精1.5min，單蒸水中浸泡>2min，2h以內。37°胃蛋白酶修復30min，PBS洗3次。1%BSA室溫封閉2h。UHRF1抗體用一抗稀釋液稀釋200x，4°濕盒孵育過夜。陰性對照組用1%BSA代替。回收抗體，PBS水洗3次，5min/次。Anti-mouse-546熒光二抗用1%BSA稀釋200x，常溫孵育2h?；厥湛贵w，PBS水洗3次，5min/次。1000x稀釋的DAPI染色15min，PBS水洗3次。防淬滅封片劑10μl滴在每個樣本上，小圓玻片覆蓋其上。全程濕盒里操作，結束后濕盒避光4°放置，1周內置熒光顯微鏡下拍照。

1.4 結果判斷熒光顯微鏡下細胞內見熒光顯影為UHRF1表達陽性，無熒光顯影為UHRF1表達陰性。

1.5 統計學方法采用SPSS19.0統計軟件。比較UHRF1在膀胱癌組織與癌旁正常組織間的表達差異；分別比較各臨床病例特征（年齡、性別、組織學類型、組織學分級、臨床分期、是否肌層浸潤）UHFR1表達情況的差異。計數資料用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UHFR1在癌組織及癌旁正常組織中的表達82例膀胱癌組織中，UHRF1表達的陽性率為78.0%（64/82），56例癌旁正常膀胱組織中表達率為10.7%（6/56）。兩者比較，差異有統計學意義（P<0.001）。見圖1、2。

圖1 癌旁正常組織中，未見UHRF1表達

圖2 癌組織中見UHRF1陽性表達

2.2 UHFR1的表達與臨床特征關系見表1。

表1 UHRF1在膀胱癌組織中的表達與臨床病理特征關系

3 討論

膀胱癌是我國泌尿生殖系腫瘤中最常見的腫瘤，男女發生率大約3∶1，好發年齡50~70歲，特點是易復發、進展，嚴重危害中老年人的健康。UHRF1基因是一種DNA甲基化蛋白，是維持DNA甲基化和組蛋白編碼的重要表觀遺傳調節因子。目前已經發現并證實其在多種癌癥組織如胃癌、前列腺癌、肺癌、宮頸癌及乳腺癌等中均存在過表達［3-6］。UHRF1可以破壞表觀遺傳密碼，其表達水平的變化調節細胞周期的進展、細胞增殖和細胞遷移［7］。

本資料結果表明，相比癌旁正常組織，膀胱癌組織中UHFR1的表達明顯增高，差異有統計學意義（P<0.001）。同時，對臨床病理特征（年齡、性別、組織學類型、組織學分級、臨床分期、是否肌層浸潤）進行分析發現，在年齡、性別、組織學類型方面，UHRF1的表達并無差異，但在有關腫瘤的生物學特點組織學分級、分期、浸潤程度上，UHRF1的表達差異有統計學意義（P<0.05）。高級別、臨床分期較高、肌層浸潤，均是膀胱癌進展和預后不佳的重要風險因素。UHRF1促進腫瘤的發生、發展的具體機制較為復雜，目前較為明確的是其通過腫瘤抑制基因如BRCA1、CDKN2A、p73和RASSF1的高甲基化引起癌細胞活化，從而促進腫瘤的進展［8］。KISS1被廣泛認為能抑制各種癌癥的轉移，是一種抑癌基因，目前有研究表明其在膀胱癌中受到高甲基化的表觀遺傳學抑制［9］。過度表達的UHRF1可能增加CPG核苷酸的甲基化，沉默KISS1的表達促進膀胱癌的侵襲［10］。

此外，本組有5例屬于非尿路上皮腫瘤（鱗癌3例，腺癌2例），其表達均為陽性，這與膀胱鱗癌、腺癌表現更高的惡性度及更差的預后相符合。但統計分析發現，與尿路上皮癌相比，差異無統計學意義，可能與收集病例數少有關。

綜上所述，本UHRF1在膀胱癌組織中高表達，并與臨床病理特征有一定關系。在膀胱癌患者中檢查UHRF1的表達水平，可能具有潛在的應用價值，并可有望成為新的分子標記物及預測疾病進展的重要指標［11］。但由于受實驗方法限制，本研究有一定局限性，如不能準確測定表達的具體數值。后期可以開展進一步相關機制研究，如通過體外腫瘤細胞培養，干擾RNA的方法降低UHRF1的表達，了解其對腫瘤細胞生物學行為的影響。