四種含抑菌成分外用制劑微生物限度檢查方法驗證

倪玉佳，湯 露，戈 煜，董文燊，瞿發林

0 引 言

醋酸氯己定洗劑、復方樟腦搽劑、含酚爐甘石涂劑及復方硝酸咪康唑軟膏均為我院自制外用制劑，分別已取得制劑批準文號［南制字（2016）B513004、南制字（2016）B513007、南制字（2016）B513006、總制字（2019）F513008］，臨床療效顯著。國家藥典委員會頒布的2015年版《中國藥典》，對藥品提出了更高的檢驗要求［1-2］，醫院制劑在微生物驗證方面存在巨大的挑戰。眾所周知，外用制劑常含乙醇、苯酚、樟腦、抗生素等抑菌成分，同時為了防止制劑因微生物污染引起腐敗變質，常常加入防腐劑延長制劑有效期，而這些物質常有較強的抑菌作用，會對微生物限度檢查方法的建立帶來極大的困難。含抑菌成分的外用制劑若采用平皿法，試驗菌回收率難以達到要求，故參照文獻［3-5］中的方法，采用薄膜過濾法進行方法適用性試驗，為我院四種外用制劑建立了方便可靠、快速便捷的微生物限度檢驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器電子天平（設備型號：EL-300J，常州天之平儀器設備公司）；潔凈工作臺（設備型號：SM-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術有限公司）；隔水式恒溫培養箱（設備型號：303-3B，南通科學儀器廠）；霉菌培養箱（設備型號：SPX-150B，上海浦東榮豐儀器公司）；電熱恒溫水浴鍋（設備型號：HHS，上海醫療器械五廠）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（設備型號：LDZX-30KBS，上海申安醫療器械廠）。

1.1.2 制劑A：醋酸氯己定洗劑（規格：200 mL；批號：20170411、20170615、20170714）；B：復方樟腦搽劑（規 格：100 mL；批 號：20170322、20170922、20180228）；C：含酚爐甘石涂劑（規格：100 mL；批號：20170329、20170922、20180322）；D：復方硝酸咪康唑軟膏（原菌克軟膏）（規格：20 g；批號：20180118、2018323、20180426）。上述制劑為本院自制。

1.1.3 菌株金黃色葡萄球菌［編號CMCC（B）26003，批號26003-5a28-5］、枯草芽孢桿菌［編號CMCC（B）63501，批號63501-2a22-1］、銅綠假單胞菌［編號CMCC（B）10104，批號10104-2a20-3］、白色念珠菌［編號CMCC（B）98001，批號98001-2a15-3］及黑曲霉菌［編號CMCC（F）98003，批號0A1001］為0 代凍干粉，均購于中國食品藥品檢定研究院，活化后使用。

1.1.4 培養基及稀釋劑培養基分別為：胰酪大豆胨液體培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號分別 為160802、1609262、161113、161017、160309、160226）。稀釋劑：pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：160801）。均由北京三藥科技開發公司生產。

1.1.5 試劑十四烷酸異丙酯（批號：20170807）、聚山梨酯80（批號：20170925），由國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌液依照2015年版《中國藥典》所要求的制備方法，分別制成試驗所需的菌懸液濃度［6］。

1.2.2 供試液A（醋酸氯己定洗劑）：供試品原液。B（復方樟腦搽劑）及C（含酚爐甘石涂劑）：各取10 mL 供試品，加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液適量，使得共100 mL，混合均勻，制成1∶10 的供試液。D（復方硝酸咪康唑軟膏）：取50 g軟膏加入50 mL無菌十四烷酸異丙酯，研磨5 min 后加入少許無菌含10%聚山梨酯80［7］的pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，繼續研磨5 min后加入500 mL已預熱的（44℃）無菌含10%聚山梨酯80 的pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，水浴保溫（44℃）靜置40 min，得到1∶10的溶液，取水層作為供試液。

1.2.3 微生物計數檢查方法的驗證①試驗組：A制劑，取供試液原液100 mL，加入相應試驗菌1 mL（菌終濃度不大于100 cfu/mL），混勻。B、C 制劑，各取“1.2.2”項下供試液100 mL，加入相應試驗菌1 mL（菌終濃度不大于100 cfu/mL），混勻。以上混勻液體，各取1 mL（每膜），薄膜過濾，用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗次數分別為10 次、5次、4 次，每次沖洗量為100 mL。轉移試驗濾膜且菌面朝上，貼于對應的瓊脂培養基平板，培養計數。D 制劑，取已制得的1∶10 供試液50 mL，分別加入各試驗菌0.5 mL（菌液終濃度不大于100 cfu/mL），混勻后1 mL 過膜，取500 mL pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（含1%聚山梨酯80）分5 次沖洗，沖洗結束后貼于對應瓊脂培養基進行培養。②供試品對照組：取制備好的供試液，用稀釋液替代所加菌液，操作方法同試驗組。③菌液對照組：用稀釋液替代所加供試液，具體操作同試驗組。④回收率計算：計算各對應試驗菌的回收率比值。回收率R 需在0.5～2 之間，否則表明驗證方法不適宜。回收率R計算公式：

1.2.4 控制菌檢查驗證因四種制劑為外用制劑，故而控制菌試驗涉及到銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌的方法驗證。①試驗組：A 制劑兩種控制菌皆采用薄膜過濾法，取供試液1 mL 每膜，1000 mL pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每次100 mL，沖洗10 次；B、C 制劑采用薄膜過濾法，取1∶10 供試液10 mL 每膜，300 mL pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每次100 mL，沖洗3 次；D 制劑，銅綠假單胞菌采用常規法，金黃色葡萄球菌采用薄膜過濾法，取1∶10 供試液10 mL 每膜，500 mL 含1%聚山梨酯80的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，每次100 mL，沖洗5 次。以上試驗組均加入不大于100cfu 的試驗菌，且D 制劑金黃色葡萄球菌檢查試驗于200 mL 的胰酪大豆胨液體培養基中進行培養，其余控制菌的檢查均于100 mL 的胰酪大豆胨液體培養基中進行培養。②供試品對照組：除不加入相應控制菌，其余操作與試驗組相同。③菌液對照組：除不加入供試液，其余操作與試驗組相同。④陰性組：除不加入相應控制菌及供試液，其余操作與試驗組相同。

2 結 果

2.1 微生物計數檢驗方法驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均在0.5～2.0，滿足驗證要求，見表1、表2。

2.2 控制菌檢查方法驗證各制劑3 批樣品控制菌檢查驗證結果顯示，試驗組均可檢出銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌，且菌液對照組陽性菌正常生長，供試品對照組及陰性組均未檢出該兩種控制菌，驗證結果滿足中國藥典要求。

表1 四種含抑菌成分外用制劑需氧菌總數的驗證回收率

表2 四種含抑菌成分外用制劑霉菌和酵母菌總數的驗證回收率

3 討 論

關于非無菌藥品的微生物限度檢查，2015年版的《中國藥典》［6］相較于2010年版的《中國藥典》［8］，無論在微生物計數部分還是控制菌檢查方面都進行了培養基、培養溫度、檢查方法等方面的調整，故而在進行含抑菌成分制劑的微生物限度適用性方法的試驗時，兩版藥典的驗證結果也不一致。按2010年版的《中國藥典》所規定的驗證方法僅需采用培養基稀釋法即可解決制劑抑菌性強的問題，但當按2015年版的《中國藥典》驗證方法時，往往試驗菌回收率達不到要求，需更換驗證方法（如薄膜過濾法）或尋求更合適的供試品處理方法（如加入中和劑、滅活劑，增加稀釋液、培養基體積）才能滿足試驗要求［6］。雖然部分制劑采用2015年版的《中國藥典》所規定的驗證方法在操作性上存在一定的困難，但該版本所規定的培養基能滿足大多數需氧菌的生長，有效提高污染菌的檢出率［9-10］，試驗最后得出的驗證方法不僅靈敏，而且更能保證廣大群眾的藥品安全。

本文所述的四種常用外用制劑多用于皮膚、黏膜消毒，皮膚瘙癢癥，皮炎等。此類制劑通常含有較強的抑菌成分，如醋酸氯己定洗劑，所含的醋酸氯己定為陽離子表面活性劑，有極強的廣譜抗菌、殺菌作用［11］；復方樟腦搽劑含樟腦、苯酚、薄荷腦、乙醇［11-13］；含酚爐甘石涂劑含苯酚［11］、爐甘石；復方硝酸咪康唑軟膏含鹽酸林可霉素（抗生素類藥）、硝酸咪康唑（廣譜抗真菌類藥）和醋酸地塞米松。故要求被試驗供試品在有效去除自身抑菌作用下才能進行污染菌限度的檢驗，否則不能確保該制劑所污染的微生物被有效地檢出。

與此同時，醋酸氯己定洗劑及復方樟腦搽劑為均相溶液劑，能順利通過濾膜；含酚爐甘石涂劑為混懸劑，振搖后為均勻的粉紅色混懸液，且所含的氧化鋅及爐甘石不溶于水，采用薄膜過濾法時會出現堵膜的情況；而復方硝酸咪康唑軟膏為軟膏劑，其基質尤為復雜，更加需要合適的處理方法才能解決過膜困難的問題，故而針對不同類型的制劑需根據各自特點采用不同驗證方案。由于目前現行版《中國藥典》刪除了離心法［6］，故本試驗將供試品含酚爐甘石涂劑靜置后取上清液進行試驗，回收率良好。另一制劑復方硝酸咪康唑軟膏，因其復雜基質及抗菌性［14］，本試驗采用含10%聚山梨酯80 的pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液處理供試品后，靜置取水層液進行試驗［15］，結果亦滿足要求。

經過試驗，建立了適合于洗劑、搽劑、涂劑、軟膏劑四種不同類型外用制劑的微生物限度檢查方法，試驗所規定的驗證菌回收率比值均在0.5～2 之間，控制菌試驗滿足實驗要求，為部分外用制劑在進行微生物限度驗證試驗前提供了參考方法，同時為醫院制劑的質量控制提供了可靠的檢測手段。