滋陰清熱藥和強的松對狼瘡小鼠血清ABTS、MDA及抗ds-DNA抗體的影響

張保平，程喜平，李楠，凡慧，梁康禮，胡小倩，張穗盈，鄧育瓊，吳元勝

(1.廣州中醫(yī)藥大學金沙洲醫(yī)院 中醫(yī)科，廣東 廣州 510168；2.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 皮膚科，廣東 廣州 510120；3.廣東省中醫(yī)院 皮膚科，廣東 廣州 510120)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)病因不清，中西醫(yī)結(jié)合治療SLE具有鮮明特色，滋陰清熱藥是國醫(yī)大師禤國維教授根據(jù)長期的臨床經(jīng)驗總結(jié)治療SLE的方劑，臨床療效確切[1]。研究顯示，眾多中藥具有良好的抗氧化的作用[2]。SLE的氧化應激反應增強，活性氧異常升高，值得關注的是，作為治療SLE的常用藥物，糖皮質(zhì)激素能增強氧化應激反應，增加活性氧的生成[3]。中藥可以抑制活性氧產(chǎn)生，減少對機體的損害[4]。滋陰清熱藥是治療SLE有效的方劑，深入研究滋陰清熱藥抗氧化作用及其生物學意義，對于探索滋陰清熱方劑的臨床應用具有積極意義。為此，本研究觀察滋陰清熱藥和強的松對MRL/lpr狼瘡小鼠血清2，2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及抗ds-DNA抗體(anti-double stranded DNA antibody，anti-ds-DNA antibody)的影響，具體如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組24只雌性MRL/lpr狼瘡小鼠模型鼠，12周齡，體質(zhì)量25.1～30.4 g，中位體質(zhì)量27.6 g。將其隨機分為4組：滋陰清熱藥組、強的松組、滋陰清熱藥和強的松合用組(合用組)、空白對照組。動物均購自南京大學動物模型實驗中心，實驗動物質(zhì)量合格證編號：44007200001471。

1.2 實驗用藥滋陰清熱方組：山萸肉15 g、生地黃20 g、茯苓15 g、澤瀉15 g、牡丹皮15 g、青蒿8 g、甘草6 g(由廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中藥房提供)，水煎后，濃縮處理(中藥含藥量為94 g)，生藥濃度為1.5 g·L-1，按照0.02 mL·g-1劑量灌胃，每日1次。強的松組：配制0.3 g·L-1的強的松(上海醫(yī)藥有限公司，國藥準字H31020675)藥液，按照0.02 mL·g-1劑量灌胃，每日1次。合用組：同時接受滋陰清熱藥和強的松藥液灌胃，方法和劑量同前。空白對照組：接受0.6 mL生理鹽水灌胃，每日1次。均干預治療3個月。

1.3 方法和試劑治療3個月后脫頸處死小鼠，心臟取血，血液在37 ℃條件下靜置30 min，3 000 r·min-1離心10 min后取血清進行ABTS、MDA和抗ds-DNA抗體檢測。

1.3.1ABTS檢測 采用快速ABTS法(碧云天，上海，中國)檢測標本的總抗氧化能力，并用mmol·g-1蛋白表示。(1)配制ABTS母液：ABTS溶液100 μL，氧化劑溶液100 μL，室溫避光存放12 h。(2)配制ABTS工作液：在使用前用PBS稀釋母液，ABTS母液200 μL，PBS 7 800 μL。(3)待測樣品的準備：血液在37 ℃條件下靜置30 min，3 000 r·min-1離心10 min后取血清，血清可直接用于測定。(4)稀釋標準溶液：使用PBS把10 mmol·L-1Trolox標準溶液稀釋成0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol·L-1。(5)總抗氧化能力的測定：①96孔板的每個檢測孔中加入200 μL ABTS工作液；②空白對照孔中加入10 μL PBS溶液，標準曲線檢測孔內(nèi)加入10 μL各種濃度的Trolox標準溶液，樣品檢測孔內(nèi)加入10 μL血清樣品，輕輕混勻；③室溫孵育2～6 min后，采用Multiskan Sky全波長酶標儀，Thermo Fisher測定734 nm的吸光度值。

1.3.2MDA檢測 采用脂質(zhì)過氧化法和硫代巴比妥酸法測定血清MDA水平(碧云天，上海)，單位：μmol·g-1。(1)配制TBA儲存液：采用TBA配制液加熱到70 ℃以促進溶解，配制成質(zhì)量濃度為3.7 g·L-1的TBA儲存液。(2)配制MDA檢測工作液：TBA稀釋液1 500 μL，TBA儲存液500 μL，抗氧化劑30 μL。(3)稀釋標準品：取適量標準品用蒸餾水稀釋至1、2、5、10、20、50 μmol·L-1，用于制作標準曲線。(4)樣品測定：①每管加入0.1 mL PBS等適當溶液作為空白對照，加入0.1 mL不同濃度標準品用于制作標準曲線，加入0.1 mL血清，隨后加入0.2 mL MDA檢測工作液；②混勻后，100 ℃水浴加熱15 min；③水浴冷卻至室溫，1 000 g室溫離心10 min，取200 μL上清加入到96孔板中，隨后用酶標儀在532 nm測定吸光度。④計算MDA：根據(jù)標準曲線計算獲得MDA的摩爾濃度。

1.3.3血清抗dsDNA抗體檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清抗ds-DNA抗體，按試劑盒說明進行相關操作。在分光檢側(cè)儀上讀取450 nm波長的OD值。

2 結(jié)果

滋陰清熱藥組ABTS水平高于其他3組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；強的松組ABTS水平低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。強的松組MDA水平高于其他3組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。滋陰清熱藥組、強的松組、合用組抗ds-DNA抗體水平均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；滋陰清熱藥組、強的松組、合用組抗ds-DNA抗體水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 滋陰清熱藥對MRL/lpr狼瘡小鼠血清ABTS、MDA及抗ds-DNA的影響

注：ABTS—2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)；MDA—丙二醛。

3 討論

正常生理狀態(tài)下，機體氧化還原反應可以產(chǎn)生低劑量的ROS，對維持機體細胞穩(wěn)態(tài)和功能有重要意義。病理狀態(tài)下，氧化應激反應產(chǎn)生超量ROS對機體十分有害，不僅可以引起氧化，形成氧化終產(chǎn)物，如丙二醛，導致蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，從而喪失功能，也能引起細胞DNA受損，誘發(fā)細胞凋亡，還能通過多種途徑誘發(fā)免疫炎癥，引起組織器官損害[5]。SLE是一種多器官受累的自身免疫性疾病。研究顯示，SLE氧化應激反應過度，生成超量活性氧，引起免疫炎癥因子異常升高，應用活性氧拮抗劑干預氧化應激，抑制或減少超量活性氧的形成，可以降低炎癥因子水平和血清抗ds-DNA抗體濃度[6]，從而緩解病情。很多植物類食物具有良好的抗氧化作用，可以減少哺乳動物活性氧的超量產(chǎn)生。中藥同樣具有良好的抗氧化作用，可以減少活性氧超量生成，減輕免疫炎癥。理論上，中藥抗氧化作用有益于SLE病情緩解。滋陰清熱藥是國醫(yī)大師禤國維教授臨床治療紅斑狼瘡的有效方劑，中藥復方成分復雜，作用靶點多，研究和闡明中藥有效方劑的機制一直是努力的方向。

ABTS法是一種常用的抗氧化檢測方法，抗氧化劑清除能力以ABTS吸光度大小與標準抗氧化劑比值做指標，比值越高，抗氧化能力越強[7]。本研究結(jié)果顯示，滋陰清熱藥組ABTS水平高于強的松組、合用組和空白對照組，說明滋陰清熱藥具有良好的抗氧化作用，提示滋陰清熱藥可以通過抗氧化途徑緩解SLE的病情。本研究結(jié)果還顯示，強的松組的抗氧化作用低于空白對照組，強的松加重氧化應激反應，理論上可以誘導免疫炎癥加重。因此，單獨從氧化應激反應角度評價強的松對SLE作用，不利于病情緩解。強的松是臨床上SLE主要用藥，在控制免疫炎癥進行性加重，穩(wěn)定病情方面具有一定療效，但強的松也有一系列不良反應，目前未查閱到糖皮質(zhì)激素加重SLE氧化應激反應后對其病情活動進一步影響的報道。機體的免疫系統(tǒng)是一個復雜網(wǎng)絡系統(tǒng)，深入研究強的松加重氧化應激反應的意義，對于減輕糖皮質(zhì)激素的副作用，改善SLE治療現(xiàn)狀具有積極意義。

滋陰清熱藥和強的松在抗氧化應激過程中的作用不同。強的松是公認治療SLE有效藥物，滋陰清熱藥同樣是治療SLE的有效藥物。為進一步明確滋陰清熱藥和強的松抗氧化應激反應的不同作用可能產(chǎn)生的臨床意義，本研究對各組進行了血清氧化終端產(chǎn)物MDA和抗ds-DNA抗體檢測。結(jié)果顯示，強的松組MDA水平高于其他3組，機體內(nèi)存在大量的不飽和脂肪酸，極易受到過氧化作用的損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化反應鏈式的終端小分子產(chǎn)物之一，是目前公認能反映活性氧超量產(chǎn)生并引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應的指標。MDA不僅是生物體氧化應激的標志物，還具有很強的毒副作用，其作用機制是極易與生物分子中的氨發(fā)生非特異性反應，導致分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)反應，引發(fā)嚴重的細胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、致突變或致癌變作用等[8]。糖皮質(zhì)激素的副作用是否和MDA有關需進一步研究。本研究結(jié)果還顯示，滋陰清熱藥組在抗氧化方面有良好的生物效果，MDA水平低于強的松組，兩者不同作用特點的臨床意義值得深入研究。本研究結(jié)果顯示，滋陰清熱藥組、強的松組、合用組的血清抗ds-DNA抗體水平均低于空白對照組，合用組、滋陰清熱藥組、強的松組抗ds-DNA抗體水平無明顯差異。以往研究顯示，SLE患者氧化應激反應增強，在活性氧激化下，抗ds-DNA抗體水平可異常升高，并加重SLE損害[9]。Maeshima等[10]發(fā)現(xiàn)維生素E通過減輕活性氧對DNA結(jié)構(gòu)，特別是線粒體結(jié)構(gòu)的損害，減少抗ds-DNA抗體生成。N-乙酰半胱氨酸是外源性活性氧拮抗劑，口服NAC可顯著降低MRL/lpr狼瘡小鼠血清自身抗體水平，改善狼瘡性腎炎[11]。本研究結(jié)果提示：盡管滋陰清熱藥和強的松抗氧化作用截然不同，滋陰清熱藥具有抗氧化作用，而強的松則能加重氧化作用，但兩者降低抗ds-DNA抗體水平卻一致，提示滋陰清熱藥治療SLE作用機制可能不同于糖皮質(zhì)激素，滋陰清熱藥和強的松對SLE具有良好的協(xié)同作用。合用組抗ds-DNA抗體水平低于滋陰清熱藥組和強的松組，推測滋陰清熱藥和強的松可能存在共同的作用機制，能有效平衡兩者抗氧化差異，顯示中西醫(yī)結(jié)合協(xié)同作用仍是主要方面。

綜上，強的松是治療SLE主要臨床用藥，控制SLE病情的同時也有明顯的副作用。滋陰清熱藥組在抗氧化方面作用優(yōu)于強的松，在抗氧化終端產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生中也優(yōu)于強的松，提示滋陰清熱藥治療SLE具有優(yōu)勢和特色。因此，循著抗氧化的途徑，深入研究滋陰清熱藥新的作用途徑，探索滋陰清熱藥的有效成分，可能取得療效更佳、副作用更小的治療SLE的有效成分，有益于推動研制具有中醫(yī)特色且療效較好的SLE新藥。