circRNA_001131通過結合miR-25-3p抑制心肌成纖維細胞中纖維化相關基因的表達*

潘 蓉，楊 靜，張 銘，朱杰寧，袁淑菁，李 暉，楊 瑩，嚴鈺敏，符永恒，單志新, △

(華南理工大學 1生物科學與工程學院， 2醫學院， 廣東 廣州 510006； 3廣東省心血管病研究所， 廣東省人民醫院， 廣東省醫學科學院, 廣東 廣州 510080)

心肌纖維化主要表現為心肌組織中大量的細胞外基質(extracellular malrix, ECM)沉積，是多種心臟疾病的重要病理特征[1]，纖維化心肌僵硬度增加，導致心臟的收縮和舒張功能異常[2]，引起惡性心律失常[3]、心肌損傷[4]、心力衰竭甚至心臟性猝死。心肌纖維化來自心肌肌成纖維細胞樣細胞的形成和活化，能夠從頭合成應力纖維、膠原蛋白(I型膠原蛋白和III型膠原蛋白)和ECM蛋白，參與心肌重構過程。目前，心肌纖維化的發生機制尚未完全闡明，尚無非常有效的臨床干預手段。

環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一種內源性的非編碼RNA，可能與多種疾病的發生相關[5]。circRNA是由mRNA前體(mRNA precursor)轉錄本通過反向剪接而成的閉合環狀的非編碼RNA，由于具有環狀閉合結構，不易受核酸外切酶的影響，在細胞內更穩定。自1976年Sanger等[6]發現circRNA以來，關于circRNA生物合成和功能的研究不斷深入。circRNA具有多種生物學功能，如海綿吸附微小RNA(microRNA，miRNA，miR)、海綿吸附蛋白及調節宿主基因轉錄和翻譯蛋白等[7]。已有研究發現circRNAs參與多種心血管疾病的發生發展過程[8]，例如CDR1as在心肌梗死小鼠心肌中表達上調，并通過靶向吸附miR-7而增加其下游靶基因PARP和SP1的表達，進而加重心肌梗死的損害作用[9]；miR-223轉基因小鼠會發生心肌肥厚和心力衰竭，ARC是miR-223的下游靶基因，而環狀RNA HRCR可內源性吸附miR-223來增加ARC表達，進而發揮抑制心肌肥厚的作用[10]。

本文將關注腹主動脈縮窄(abdominal aortic coarctation，AAC)手術誘導的心肌纖維化大鼠心肌中差異表達變化的circRNAs，并研究其中表達增強的circRNA_001131對心肌纖維化的調控作用。circRNA_001131來自于宿主基因第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,Pten)，Pten蛋白具有抑制心肌纖維化的作用[11]，但circRNA_001131對心肌纖維化相關基因表達的調控作用尚不清楚。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級Sprague-Dawley(SD)乳大鼠，雌雄不限，1～3 d，由南方醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2016-0041。

2 主要試劑

DMEM/F12細胞培養基購自HyClone；特級澳洲胎牛血清和0.25% EDTA-胰蛋白酶購自Gibco；ribonuclease R (RNase R)購自廣州吉賽生物；放線菌素D購自生工有限公司；細胞核/細胞質RNA提取試劑盒購自Norgen Biotek；TRIzol和逆轉錄試劑盒購自Invitrogen；SYBR Green Mix購自TaKaRa；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天；抗GAPDH抗體和抗Col3a1抗體購自Protein Technology;抗Col1a1抗體購自Thermo;抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體購自Abcam；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo；ECL發光液購自Millipore；PVDF膜購自Whatman；引物均來自Invitrogen，見表1；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

表1 PCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

F: forward; R: reverse.

3 主要方法

3.1大鼠腹主動脈縮窄模型制備 用數字標簽隨機分組法，將20只雄性SD大鼠分為假手術組和模型組，每組各10只動物。將手術器械術前高壓滅菌，用氯胺酮(4 mg/kg)合用地西泮(40 mg/kg)麻醉大鼠，于腿部肌注，待其麻醉后，先用剃毛剪將腹部毛剪凈，再涂抹脫毛劑，濕布擦除干凈，完全暴露腹部皮膚，保證術中大鼠呼吸通暢。沿腹白線剪開皮膚，剖開腹部肌肉，輕輕將胃腸按順序取出，置于無菌紗布上，暴露腹主動脈，剪開肌膜，鈍性分離左右兩腎動脈分支間的腹主動脈區域，期間應用生理鹽水保持大鼠內部臟器濕潤。暴露腹主動脈并在雙腎動脈上方分離腹主動脈，用0.3 mm銀夾造成腹主動脈部分狹窄。將各臟器歸復原位，用縫合線縫合腹部肌肉和皮膚。用消毒碘伏涂抹傷口處，放在溫暖處，于術后前3 d肌注青霉素鈉(每天20×105U)。假手術組操作與模型組相同，但只剝離腹主動脈，不使用銀夾縮窄。

3.2Masson三色染色 腹腔注射2 mL/kg戊巴比妥麻醉大鼠，取左心室心肌組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋并切成4 μm厚度的連續切片，Masson膠原纖維染色，觀察心臟組織的膠原纖維增生情況，分析評價AAC模型大鼠和對照大鼠心肌的纖維化程度。用膠原體積分數(collagen volume fraction，CVF)分析心肌的纖維化程度，選擇8個單獨的視圖(放大率=原始×400)，并使用以下公式評估CVF：CVF(%)=膠原面積/總面積×100%。

3.3circRNAs芯片檢測 取AAC手術組和假手術組大鼠心肌組織進行circRNAs表達譜分析,芯片雜交和結果分析由上?？党晒緟f助完成。簡要步驟如下：先用RNase R消化大鼠心肌組織總RNA，去除線性RNA, 富集circRNAs。將富集后的circRNAs 采用隨機引物轉錄、擴增為熒光標記的cRNA探針(Arraystar Super RNA Labeling Kit)。cRNAs 探針與Arraystar Human circRNA Array(8×15K)表達譜芯片上的寡核苷酸片段雜交，AgilentScanner G2505C掃描，Agilent Feature Extraction Software (Version 11.0.1.1)分析雜交結果。

3.4乳大鼠心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts, CFs)的原代分離培養 將出生1～3 d SPF級SD乳大鼠的心肌組織，以0.08%胰蛋白酶和0.08%膠原酶混合液消化，分離CFs。離心棄去上清液，沉淀用完全培養基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM/F12培養基)重懸細胞，培養于25 cm2培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，1.5 h后根據差速貼壁原理分離心肌細胞和CFs，置于培養箱中培養。

3.5circRNA_001131重組腺病毒的構建和包裝 根據大鼠circRNA_001131模板DNA序列和腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV多克隆位點序列，設計合成引物，通過PCR擴增得到circRNA_001131 模板的DNA插入片段，按照我們已報道的方法[12]，將circRNA_001131片段定向插入到pAdTrack-CMV載體的多克隆位點。并進一步將pAdTrack-CMV-circRNA_001131與pAdEasy-1在E.ColiBJ5183中進行重組。最后，重組circRNA_001131腺病毒載體用限制性內切酶PacI線性化，轉染至293T細胞中，包裝重組腺病毒。

3.6細胞處理 用rAd-circRNA_001131感染CFs：取傳至第2代(P2)乳大鼠CFs接種于12孔板(每孔細胞密度2×105)，細胞貼壁過夜，分別感染rAd-GFP或rAd-circRNA_001131大約4 h 后，再行含5%胎牛血清的培養基繼續培養24 h。用miR-25-3p mimic轉染CFs：取1.75 μL脂質體至50 μL DMEM/F12培養基中充分混勻，室溫靜置5 min；同時將miR-25-3p mimic和scrambled對照分別加至50 μL DMEM/F12培養基中充分混勻，室溫靜置5 min；再用移液器分別上述2種混合物充分混勻，室溫靜置20 min；取100 μL miR-25-3p mimic/scrambled脂質體復合物加至細胞孔中(miR-25-3p mimic/scrambled終濃度為100 nmol/L)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，轉染24 h后結束實驗。

3.7RNase R和放線菌素D實驗 將P2乳大鼠CFs接種于6孔板中，貼壁后低血清培養過夜。分別用2 g/L放線菌素D行0、4、8、12和24 h處理后提取細胞總RNA。提取過表達circRNA_001131的大鼠CFs總RNA，用RNase R在37℃孵育0～30 min，70℃孵育10 min使酶滅活，RT-qPCR檢測circRNA_001131和其宿主基因Pten的mRNA表達。

3.8RT-qPCR檢測circRNA_001131和纖維化相關基因的表達 用TRIzol試劑提取CFs總RNA，取1.0 μg總RNA，加入5×逆轉錄試劑4 μL，用oligo(dT)15和random primers逆轉錄出cDNA，用于檢測circRNA_001131和纖維化相關基因的mRNA表達水平，分別以U6和GAPDH作為檢測內參照。在ViiA 7 Quantitative PCR System (Applied Biosystems)進行PCR和結果分析。以2-ΔΔCt法計算circRNA_001131和纖維化標志物的相對表達水平。

3.9Western blot法檢測蛋白水平 處理后的大鼠CFs加入蛋白裂解液RIPA，冰上裂解，吸取裂解液后4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清進行蛋白質定量、分裝，加入4×上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白質變性。然后進行SDS-PAGE，用PVDF膜轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后用相應的抗體anti-Col1a1(1∶2 000)、anti-Col3a1(1∶2 000)和anti-α-SMA(1∶3 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3遍，加入相應來源的 II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗3遍后用ECL發光試劑盒顯影，以GAPDH(1∶5 000)為內參照，掃描灰度值并分析蛋白表達相對含量。

3.10雙螢光素酶報告實驗驗證circRNA_001131與miR-25-3p的結合作用 參照文獻方法[13]分別構建包含潛在miR-25-3p結合序列的重組螢光素酶報告質粒pGL3-circRNA_001131及包含結合序列突變的重組質粒pGL3-circ_001131-Mut。將HEK293細胞(細胞密度約為每孔1×105)轉染1.5 μg重組螢光素酶報告質粒，100 nmol/L miR-25-3p mimic以及10 ng pRL-TK(表達海腎螢光素酶的內參照質粒)。轉染24 h后，測定螢火蟲螢光素酶(FL)及海腎螢光素酶(RL)相對活性，FL/RL可反映circRNA_001131與miR-25-3p結合的能力。

4 統計學處理

用SPSS 25.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用獨立t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni 校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 circRNA_001131在AAC手術大鼠心肌中表達上調

與假手術組大鼠相比，AAC手術組大鼠心臟外觀明顯變大，Masson染色顯示心肌間質膠原沉積加劇，CVF明顯升高(P<0.01),見圖1A。circRNA芯片檢測結果顯示，AAC手術組大鼠心肌中呈2倍以上上調或下調表達的circRNAs分別有126和187個,見圖1B。RT-qPCR證實，與對照組相比，AAC手術組大鼠心肌中circRNA_001131和其宿主基因Pten表達均顯著升高(P<0.01),見圖1C。DNA測序列結果證實PCR產物中包含的circRNA_001131特異性接頭序列正確,見圖1D、E。

Figure 1. circRNA_001131 expression in the myocardium of rat ACC model. A: Masson trichrome staining (scale bar=100 μm); B: the scatter plot figure showed the representative up- or down-regulated circRNAs in the myocardium of rat AAC model; C: the expression of circRNA_001131 and Pten mRNA in the myocardium of rat AAC model detected by RT-qPCR; D: schematic diagram of the source of circRNA_001131; E: PCR product of circRNA_001131 was identified by 1.2% agarose gelelectrophoresis and DNA sequencing assay. M: DL2000 DNA marker (from up to down, 2 000, 1 000, 750, 500, 250 and 100 bp); Lane 1: cDNA of rat myocardium; Lane 2: rat genomic DNA. Mean±SEM.n=5～8.*P<0.05,**P<0.01vssham group.
圖1 circRNA_001131在AAC模型大鼠心肌中的表達

2 circRNA_001131在血管緊張素II(angiotensin-II, Ang-II)處理的大鼠CFs中表達上調

我們用10 μmol/L Ang-II處理乳大鼠CFs，RT-qPCR結果顯示纖維化相關基因Col1a1、Col3a1和Acta2(編碼α-SMA)，circRNA_001131及其宿主基因Pten表達顯著增加(P<0.05),見圖2A；核質RNA分離和RT-qPCR實驗結果顯示，circRNA_001131主要存在于大鼠CFs的胞質中，而GAPDH和U6分別在胞質和胞核中富集存在,見圖2B。RT-qPCR結果顯示，用放線菌素D和RNase R處理后，Pten的mRNA水平顯著降低，而circRNA_001131降低不明顯，說明大鼠CFs中circRNA_001131有較好的穩定性，見圖2C、D。

Figure 2. Identifications of expression, distribution and stability of circRNA_001131 in 10 μmol/L Ang-II-treated rat CFs. A: the expression of Col1a1, Col3a1, Acta2, circRNA_001131 and Pten in Ang-II-induced rat CFs detected by RT-qPCR; B: the distribution of circRNA_001131, GAPDH and U6 in rat CFs; C: RT-qPCR analysis of circRNA_001131 and Pten expression in rat CFs exposed to actinomycin D; D: RT-qPCR analysis of circRNA_001131 and Pten mRNA level post RNase R treatment. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank group;##P<0.01vsPten;△P<0.05vsmock group.
圖2 circRNA_001131在AngⅡ處理的大鼠CFs中的表達、分布和穩定性的鑒定

3 circRNA_001131抑制大鼠CFs中纖維化相關基因表達

利用構建的重組circRNA_001131的腺病毒(rAd-circRNA_001131)感染P2乳大鼠CFs，24 h 后熒光倒置顯微鏡下觀察，rAd-circRNA_001131共表達的綠色熒光蛋白水平顯示腺病毒感染CFs充分，見圖3A。RT-qPCR證實circRNA_001131在大鼠CFs中充分過表達(P<0.01)，見圖3B;RT-qPCR和Western blot結果顯示，在過表達circRNA_001131的大鼠CFs中纖維化相關基因Col1a1和Col3a1表達顯著下調(P<0.01)，而Acta2變化不顯著,見圖3C、D。

4 miR-25-3p可減弱circRNA_001131對心肌纖維化的抑制作用

序列分析提示，circRNA_001131的第218～238堿基可能是miR-25-3p的結合位點，見圖4A。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-25-3p模擬物與pGL3-circRNA_001131質粒共轉染HEK293細胞后，螢光素酶活性較對照組顯著下降，而共轉染pGL3-circRNA_001131-Mut質粒的螢光素酶活性無明顯變化，見圖4A。利用P2乳大鼠CFs，先行感染rAd-circRNA_001131后再轉染100 nmol/L miR-25-3p mimic，24 h后檢測纖維化相關基因的表達情況。Western blot結果顯示，過表達circRNA_001131的大鼠CFs中Col1a1和Col3a1表達顯著降低，轉染miR-25-3p可減弱circRNA_001131對Col1a1和Col3a1表達的抑制作用(P<0.01)，見圖4B。

Figure 3. The effect of circRNA_001131 on the expression of Col1a1, Col3a1 and α-SMA/Acta2 in rat CFs. A: adenovirus-mediated over-expression (OE) of circRNA_001131 in rat CFs (the infection of the recombinant circRNA_001131 adenovirus was monitored by the co-expressed marker of GFP; scale bar=100 μm); B: the expression of circRNA_001131 was determined by RT-qPCR; C: the mRNA expression of Col1a1, Col3a1 and Acta2 in CFs was detected by RT-qPCR; D: the protein expression of Col1a1, Col3a1 and α-SMA in CFs was determined by Western-blot. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsvector group.
圖3 circRNA_001131對大鼠CFs中Col1a1、Col3a1和α-SMA表達的影響

討 論

近年來，隨著RNA測序技術的廣泛應用，研究者在不同物種中發現大量的circRNA存在，并具有物種、組織特異性。越來越多的研究表明，circRNA與腫瘤[14]、神經系統疾病[15]和心血管疾病[16]的發生密切相關。研究發現，circHIPK3在AngⅡ處理的成纖維細胞和心肌組織中表達上調，抑制circHIPK3可減少對miR-29b-3p的吸附作用而抑制成纖維細胞增殖、遷移及纖維化相關基因的表達[17]。我們既往證實circRNA_000203在糖尿病小鼠心肌中高表達，它可以通過特異結合miR-26b-5p，促進Col1a2和Ctgf的表達來發揮促心肌纖維化作用[18-19]。

本文發現，在AAC誘導的大鼠心肌纖維化模型中，circRNAs表達譜出現顯著的差異變化，提示circRNAs可能參與了心肌纖維化的發生過程。環狀RNA是不具有5’端帽子和3’端polyA尾的環狀非編碼RNA，更加耐受核酸內切酶，因而較線形mRNA更穩定[20]。我們的結果顯示，在利用放線菌素D處理后，線性Pten mRNA隨時間延長降解增多，而circRNA_001131無明顯變化。當用RNase R處理時后，Pten mRNA水平顯著下降，而circRNA_001131降解不明顯。上述結果說明circRNA_0011311有很好的細胞穩定性，符合環形RNA的特征。

Figure 4. miR-25-3p reversed the inhibitory effect of circRNA_001131 on the expression of fibrosis-associated genes in CFs. A: verification of miR-25-3p as a target gene of circRNA_001131 by dual-luciferase reporter assay; B: the protein expression of Col1a1, Col3a1 and α-SMA in CFs was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vspGL3-promoter group;△P<0.05,△△P<0.01vsvector group;#P<0.05,##P<0.01vsOE-circRNA_001131 group.
圖4 miR-25-3p可以減弱circRNA_001131對心肌纖維化的抑制作用

我們發現過表達circRNA_001131后的CFs中Col1a1和Col3a1表達下調，提示circRNA_001131與其宿主基因Pten均具有抑制心肌纖維化的作用。過表達circRNA_001131不影響CFs中Acta2表達，提示circRNA_001131不影響CFs向肌成纖維細胞的轉化過程。鑒于circRNA_001131主要存在于CFs的胞質中，胞質中的circRNA可能通過吸附特異的蛋白、吸附miRNAs和翻譯成蛋白/多肽等方式發揮生物學功能[7]，例如circPABPN1可吸附RNA結合蛋白HuR而抑制HuR與多腺苷酸結合蛋白核1(polyadenylate-binding protein nuclear 1,PABPN1)的結合，進而抑制PABPN1的翻譯而抑制細胞增殖[21]。circ-ZNF609含有一個753個堿基的開放閱讀框，可以翻譯出蛋白來調控心肌生成[22]。本文從circRNA_001131可能通過特異結合某些miRNAs的途徑來探究其發揮抑制心肌纖維化作用機制。生物信息學分析結果提示，miR-25-3p與circRNA_001131上存在結合位點，雙螢光素酶報告基因實驗驗證了miR-25-3p與circRNA_001131間的結合作用。功能實驗進一步證實，轉染miR-25-3p可以特異地減弱circRNA_001131對心肌纖維化的抑制作用，上述結果表明circRNA_001131可通過結合miR-25-3p發揮抑制CFs中Col1a1和Col3a1表達的作用，但參與介導circRNA_001131發揮抑制心肌纖維化作用的miR-25-3p靶基因尚待進一步確認。我們證實circRNA_001131與miR-25-3p只有一個結合位點，并參與介導circRNA_001131抑制心肌纖維化的作用，但不排除circRNA_001131也可以結合其它的miRNAs或RNA結合蛋白來介導其生物學功能。

綜上所述，我們發現circRNA_001131在AAC誘導纖維化的大鼠心肌和Ang-II處理的大鼠CFs中表達上調。在CFs中過表達circRNA_001131后，纖維化相關基因Col1a1和Col3a1表達下調，而miR-25-3p可減弱circRNA_001131抑制心肌纖維化的作用。本文明確了circRNA_001131通過結合miR-25-3p發揮抑制心肌纖維化的作用，但其下游作用靶基因還有待于進一步探究。