HMGB2對肺腺癌細胞周期和增殖的影響*

付 蓓，賀惠娟

(湖北中醫(yī)藥大學， 湖北 武漢 430065)

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年約有180萬人因肺癌死亡[1]。依照組織病理學分類，肺癌可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌[2]，其中非小細胞肺癌占大多數，約85%左右。非小細胞肺癌包括肺腺癌和肺鱗癌，有資料表明，肺腺癌發(fā)病率增長迅速[3]。外科手術是目前早期肺腺癌治療的首選方式，盡管如此，由于早期發(fā)病隱蔽，不易診斷，一旦發(fā)現已到中晚期并可能伴有轉移，導致其病死率高。因此，亟需深入研究肺腺癌的發(fā)病機制，尋找高敏感性和特異性的腫瘤標志物，以期為早期診斷和防治及預后判斷提供更為可靠依據。高遷移率族蛋白B2(high-mobility group protein B2，HMGB2)是HMG蛋白家族成員之一，研究發(fā)現它與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[4-5]。但目前HMGB2在肺腺癌中的作用尚無報道，本研究基于腫瘤網絡數據庫探究HMGB2在肺腺癌中的表達及其與細胞功能狀態(tài)和預后的關系，并進一步探究其在肺腺癌發(fā)生中的可能作用機制。

材 料 和 方 法

1 生物信息學資料分析

采用Cancer RNA-Seq Nexus (CRN)數據庫(http://syslab4.nchu.edu.tw)分析肺腺癌組織HMGB2表達情況；采用OncoLnc數據庫(http://www.oncolnc.org)分析HMGB2表達與肺腺癌或肺鱗癌預后的相關性；采用COX回歸法進行高/低表達組生存分析，該數據庫肺癌資料均來源于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫；采用腫瘤單細胞數據庫(http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/)分析HMGB2基因表達與癌細胞14種功能狀態(tài)的相關性，并進一步分析HMGB2基因表達與肺腺癌細胞功能狀態(tài)的相關性。

2 材料和儀器

人肺腺癌A549細胞購自中科院上海細胞庫。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰酶和青鏈霉素雙抗購自Gibco；PrimeScriptTMRT reagent Kit和TB Green? Premix Ex TaqTM購自大連寶生物公司；CCK8檢測試劑盒購自上海東仁科技公司；HMGB2引物序列引物由上海生工生物工程公司合成；靶向HMGB2的siRNA和riboFECT CP Transfection Kit購自廣州銳博生物公司；抗HMGB2抗體購自Abcam。CO2培養(yǎng)箱為Thermo產品；熒光定量PCR儀為ABI產品；熒光顯微鏡為Olympus產品；酶標儀為BioTek產品；蛋白電泳分離、轉膜和成像系統為Bio-Rad產品。

3 方法

3.1細胞培養(yǎng)和轉染 A549細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，細胞生長至80%左右融合度時傳代，取狀態(tài)良好的對數生長期細胞進行實驗研究。取對數生長期的A549細胞分為對照(control)組、NC-siRNA組和HMGB2-siRNA組，按照riboFECT CP Transfection Kit說明書步驟進行細胞轉染操作，采用real-time PCR和Western blot檢測HMGB2水平來評價轉染效率。

3.2Real-time PCR和Western blot檢測A549細胞HMGB2的表達 將A549細胞按每孔5×105個接種于6孔板，依照不同分組進行實驗處理，48 h后用TRIzol裂解液提取總RNA，操作按試劑說明書進行，再用PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA逆轉成cDNA，操作按試劑盒說明書進行。用TB Green? Premix Ex TaqTM進行檢測，real-time PCR 程序為 95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。以GAPDH為內參照，采用2-ΔΔCT法對HMGB2 mRNA表達進行相對定量分析[6]。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1. Primer sequences for real-time PCR

將A549細胞按每孔5×105個接種于6孔板，依照不同分組進行實驗處理，48 h后用RIPA裂解液收集細胞總蛋白，BCA定量后煮沸蛋白變性。取30 μg總蛋白，10%的SDS-PAGE膠分離蛋白后轉膜至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h后，HMGB2抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，II 抗(1 ∶5 000)室溫避光孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光后成像系統進行圖像采集及灰度分析。

3.3CCK8和EdU實驗檢測A549細胞增殖 將A549細胞按每孔5×103個接種于96孔板，依照不同分組進行實驗處理，48 h后每孔加入10 μL的CCK8試劑，37 ℃孵育2 h后通過酶標儀測定450 nm的吸光度(A)值。將A549細胞按每孔5×105個接種于6孔板，依照不同分組進行實驗處理，48 h后每孔加入1 mL 50 μmol/L EdU培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h，PBS清洗后多聚甲醛固定，細胞破膜后Apollo染色和DAPI染核30 min，PBS清洗后熒光顯微鏡下觀察拍照。

4 統計學分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5軟件進行數據處理和圖片繪制，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，其中兩兩比較選擇Bonferroni校正的t檢驗進行，以P<0.05代表差異有統計學意義。

結 果

1 肺腺癌組織HMGB2基因表達

采用CRN數據庫分析肺腺癌組織HMGB2表達情況，結果顯示，肺腺癌組織中HMGB2表達較正常肺組織高，依照腫瘤分期不同，正常、ⅠA期、ⅠB期、ⅡA期、ⅡB期、ⅢA期、ⅢB期和Ⅳ期的HMGB2表達的TPM均數分別為41.67、70.96、89.24、90.35、94.54、80.26、93.94和107.0，見圖1。

Figure 1.HMGB2gene expression in lung adenocarcinoma tissues.
圖1 肺腺癌組織HMGB2基因表達

2 HMGB2基因表達與肺腺癌/肺鱗癌患者預后關系

利用OncoLnc數據庫分別分析HMGB2表達與肺腺癌或肺鱗癌預后的相關性，結果顯示，肺腺癌患者中，HMGB2高表達組患者總生存期明顯低于HMGB2低表達患者(log-rank檢驗P=0.0173)；而肺鱗癌患者中，HMGB2高表達組患者總生存期與HMGB2低表達患者無明顯差異(log-rank檢驗P=0.142)，見圖2。

3 HMGB2基因表達與癌細胞功能狀態(tài)的相關性

利用CancerSEA網站分析HMGB2與惡性腫瘤細胞14種功能狀態(tài)的相關性，結果顯示，HMGB2表達與細胞多種功能狀態(tài)相關，其中與細胞周期和增殖呈正相關，見圖3。我們進一步對于HMGB2與2項肺腺癌(LUAD)細胞功能狀態(tài)的相關性進行分析，該肺腺癌數據來源于2個不同研究[Kim KT. Genome Biol. 2015；Guillaumet-Adkins A. Genome Biol. 2017]，癌細胞數量分別為126個和42個。結果顯示，HMGB2表達與肺腺癌細胞周期和增殖呈正相關，2個肺腺癌數據的相關系數分別為0.825/0.740和0.673/0.643，見圖4。

Figure 2. Relationship betweenHMGB2gene expression and prognosis of the patients with lung adenocarcinoma (LUAD) and squamous-cell carcinoma (LUSC).
圖2HMGB2基因表達與肺腺癌/肺鱗癌患者預后關系

4 HMGB2-siRNA對人肺腺癌A549細胞的沉默效果

通過siRNA轉染敲減A549細胞HMGB2的表達，并驗證沉默效果，結果顯示，與對照組相比，NC-siRNA組HMGB2的mRNA和蛋白表達均無明顯差異(P>0.05)；而與NC-siRNA組相比，HMGB2-siRNA組HMGB2的mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見圖5。

5 HMGB2對人肺腺癌A549細胞增殖的影響

通過CCK8和EdU實驗檢測A549細胞的增殖情況，結果顯示，與對照組相比，NC-siRNA組的細胞活力和增殖能力無明顯差異(P>0.05)；而與NC-siRNA組相比，HMGB2-siRNA組的細胞活力和增殖能力顯著降低(P<0.05),見圖6。

討 論

肺腺癌是最常見的肺癌類型，約占肺癌的40%，其從小氣道上皮II型肺泡細胞轉化發(fā)展而來，能夠分泌黏液和其他物質[7]。肺腺癌是一種惡性程度和致死率高的腫瘤類型，中晚期患者總生存率往往不超過5年。有鑒于此，亟需探究肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，有助于探尋早期肺腺癌防診治和預后的分子靶標。

高遷移率族蛋白是一種廣泛存在于真核細胞內的染色質蛋白質，其家族成員包括HMGB1～4，在染色質的結構與功能及基因表達調控過程中發(fā)揮著重要作用[8]。其中HMGB1是研究最為廣泛的成員，其首先被發(fā)現作為晚期炎癥介質在膿毒癥中發(fā)揮作用[9]。HMGB1在組織損傷后釋放并激活機體免疫系統，與許多風濕免疫性疾病密切相關[10]。研究報道HMGB1可以通過多種信號通路參與腫瘤的進展，迄今為止，世界各地的不同研究團隊已報道了HMGB1在肝、肺、乳腺、結腸直腸、前列腺、宮頸和卵巢腫瘤中發(fā)揮作用[11]。HMGB家族成員結構上高度同源，鑒于此，HMGB2是否與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關也受到研究者的關注，有報道表明其與一些腫瘤的發(fā)生關系密切。Cui等[5]研究發(fā)現HMGB2能促進胃癌的惡性程度及不良預后；石小康等[12]發(fā)現HMGB2高表達與肝癌患者臨床病理及預后顯著相關。但HMGB2在肺腺癌中的作用和具體機制目前尚不清楚，有待進一步深入研究。

Figure 3. Correlation betweenHMGB2gene expression and functional status of cancer cells in different malignant tumor cells.
圖3 不同惡性腫瘤細胞HMGB2基因表達與癌細胞功能狀態(tài)的相關性

Figure 4. Correlation betweenHMGB2gene expression and functional status of cancer cells in lung adenocarcinoma cells.
圖4 肺腺癌細胞HMGB2基因表達與癌細胞功能狀態(tài)的相關性

Figure 5. The silencing effect of siRNA onHMGB2expression in human lung adenocarcinoma A549 cells. A: the results of real-time PCR; B: the images and the quantitatative analysis of Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC-siRNA group.
圖5 siRNA對人肺腺癌A549細胞HMGB2的沉默效果

Figure 6. Effect of HMGB2 on the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells. A: the quantitatative analysis of CCK8 assay; B: the images and the quantitatative analysis of the EdU assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC-siRNA group.
圖6 HMGB2對人肺腺癌A549細胞增殖的影響

本文通過腫瘤基因表達譜數據分析發(fā)現HMGB2在肺腺癌中高表達，再利用最新的單細胞數據庫顯示HMGB2基因表達與肺腺癌細胞周期和增殖呈密切的正相關關系，同時HMGB2高表達組患者總生存期明顯低于HMGB2低表達患者。提示HMGB2高表達可通過細胞周期調控增殖，參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。真核細胞通過調控細胞周期維持機體的正常代謝和增殖，細胞周期調控的改變能使得細胞增殖能力增強，異常增殖的腫瘤細胞是其發(fā)生的病理生理基礎，因此，細胞周期和增殖相關調控信號機制成為抗腫瘤研究的熱點[13]。本研究進一步在肺腺癌A549水平驗證了HMGB2對增殖的調控，利用siRNA沉默HMGB2表達后，A549細胞增殖能力減弱，提示HMGB2確實能參與肺腺癌細胞增殖的調控。劉愛蕙等[14]通過沉默HMGB2基因也發(fā)現可顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖；Kwon等[15]使用siRNA沉默肝癌細胞HMGB2后證實可以有效抑制細胞的增殖和克隆形成。這些證據和我們的研究結果一致，均表明HMGB2在肺腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖中起著關鍵作用。

本文利用腫瘤生物信息學網絡分析了HMGB2在肺腺癌組織中高表達及與患者預后關系密切，發(fā)現HMGB2與肺腺癌細胞周期和增殖呈現正相關；進一步在肺腺癌A549細胞水平上抑制HMGB2表達，證實其對細胞活力和增殖的調控。這提示HMGB2可以作為潛在的評估肺腺癌患者預后的標志物和治療靶標，為肺腺癌的防治提供新思路。