尼古丁通過調節巨噬細胞極化加重實驗性脈絡膜新生血管的形成*

鞏亞軍，賴坤貝，李龍輝，黃創新，許發寶，周立軍，金陳進

(中山大學中山眼科中心眼科學國家重點實驗室， 廣東 廣州 510060)

年齡相關性黃斑變性(age-related macular dege-neration, AMD)是發達國家60歲以上人群中首要的不可逆性致盲眼病,AMD導致中心視力下降甚至失明而嚴重影響患者的生活質量，給家庭和社會造成了極大的經濟負擔[1-2]。晚期AMD一般分為地圖樣萎縮和新生血管性或濕性AMD，脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是濕性AMD的典型特征[3]。AMD是基因和環境共同作用的多因素疾病，在眾多危險因素中，吸煙被認為是最重要的可修正因素，而尼古丁是香煙中最重要的有害生物活性物質[4-5]。動物實驗和臨床研究均證實香煙中的尼古丁可加重CNV病情[6-7]，而且吸煙對CNV病情的有害作用即使在戒煙后仍可持續將近20年[8]。令人遺憾的是，吸煙加重CNV病情的原因至今不明，因此目前臨床上無任何手段能有效阻止吸煙患者CNV 病情的惡化。而我國吸煙人數眾多，由吸煙導致CNV患者病情惡化的情況不容忽視，迫切需要將吸煙加重CNV病情的機制進行詳細研究。

濕性AMD的病理過程以多種細胞的增殖和(或)浸潤為特點，包括視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞、巨噬細胞、神經膠質細胞和成纖維細胞[9],而巨噬細胞被認為是AMD病灶中最重要的炎癥浸潤細胞，在CNV的發展中具有重要的作用[10],但巨噬細胞在尼古丁加重CNV的過程中發揮著何種作用迄今未知。因此，本實驗通過尼古丁暴露的激光誘導小鼠CNV模型探究巨噬細胞在尼古丁加重CNV中所發揮的重要作用及其機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實驗動物 C57BL/6J小鼠74只，6～8周，雄性，SPF級，購自廣東省醫學實驗動物中心(合格證號： No.44007200044340; No.44007200046721; No.44007200050429; No.44007200048117)，實驗動物的飼養條件及使用遵循國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》。

1.2主要試劑及儀器 尼古丁、TRIzol和異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-labeled dextran,FITC-dextran)均購自Sigma;熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥公司);大鼠抗小鼠F4/80抗體(Bio-Rad);兔抗小鼠誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抗體、山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗大鼠Ⅱ抗(CST);兔抗小鼠CD206抗體(Abcam);VECTASHIELD?Mounting Medium水溶性封片劑(H-1000，VECTOR);實時熒光定量PCR試劑盒和反轉錄試劑盒(大連寶生物公司);引物(Thermo Fisher);白細胞介素6(interleukin-6，IL-6) ELISA Kit、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA Kit、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)ELISA Kit和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)ELISA Kit (R&D);PMSF和RIPA(CST)。810紅外半導體激光器(IRIDEX);裂隙燈顯微鏡(Zeiss);小鼠角膜接觸鏡(Ocular);MicronⅢ小鼠視網膜成像系統(Phoenix Research);冰凍切片機(Lecia);酶標儀(Bio-tex);熒光定量PCR儀(Roche);熒光顯微鏡(OLYMPUS)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)。

2 方法

2.1實驗分組及處理 6～8周的C57BL/6J小鼠由廣東省醫學實驗動物中心購進后，隨機分為實驗組和對照組，每組小鼠均給予相同體積的飲用水，但實驗組飲水中按100 mg/L的劑量加入尼古丁。為保證飲水的新鮮，每天更換。飼養4周后采用激光光凝建立CNV小鼠模型。本實驗經中山大學中山眼科中心動物倫理委員會的批準(2016-106)，實驗中嚴格遵循動物福利和倫理準則。

2.2小鼠脈絡膜新生血管激光誘導模型的建立 尼古丁或水飼養4周后采用激光誘導脈絡膜新生血管模型，具體操作流程如下:復方托吡酰胺充分散瞳，4.3%的水合氯醛經腹腔注射麻醉小鼠(10 mL/kg)，充分麻醉后鹽酸丙美卡因點眼以降低角膜敏感性，2%的羥甲基纖維素作為耦合劑，用810紅外半導體激光器造模(激光參數：50 μm，50 ms，250 mW)，在距離視乳頭2PD處3、6、9及12 鐘點行視網膜光凝，光凝后以能看見有白色氣泡產生提示Bruch’s膜被擊穿為標準，4點均符合此標準者才入選為研究對象，光凝處視網膜出血者排除。造模結束后雙眼涂妥布霉素眼膏，置于保溫毯復蘇后放回飼養間。

2.3小鼠眼底血管熒光造影檢測滲漏程度 造模7 d后行熒光素眼底血管造影術(fluorescein fundus angiography，FFA)，復方托吡酰胺散瞳，4.3%的水合氯醛經腹腔注射麻醉小鼠(10 mL/kg)，充分麻醉后鹽酸丙美卡因點眼，修剪小鼠胡須，滴2%的羥甲基纖維素于目標眼，用視網膜成像系統拍攝小鼠眼底彩照，觀察激光斑是否存在。1%的熒光素鈉，按照10 mL/kg的劑量腹腔注射，觀察小鼠早期(1 min)和晚期(5 min)的熒光素鈉滲漏情況，采用Krzystolik等[11]的方法將激光斑按熒光素滲漏程度分為4級：1級，無滲漏，光斑無高熒光；2級，輕度滲漏，光斑有高熒光但無熒光素滲漏；3級，中度滲漏，光斑高熒光，伴有輕度熒光素滲漏，但滲漏不超過光斑邊界；4級，重度滲漏，光斑高熒光，伴有顯著熒光素滲漏，且滲漏超過光斑邊界。結束后雙眼涂妥布霉素眼膏，置于保溫毯復蘇后放回飼養間。

2.4脈絡膜鋪片測量小鼠CNV面積大小 造模后第7天，4.3%水合氯醛(10 mL/kg)充分麻醉小鼠，用大頭針將小鼠四肢固定在泡沫板，從腹中部剪開腹腔直至劍突下，剪開橫膈，血管鉗夾住胸主動脈。暴露心臟，剪開右心耳，將1 mL的FITC-dextran溶液(使用前用PBS配成50 g/L)從左心室快速注入。灌注成功的標志為小鼠舌頭及四肢變黃，手術顯微鏡下可見視網膜的血管被黃綠色熒光素充盈。摘除灌注成功的小鼠眼球，4%多聚甲醛固定2 h。手術顯微鏡下剔除肌肉纖維組織，從赤道部剪開眼球，去除前節，小心將玻璃體視網膜神經上皮層剝離，剩余RPE-脈絡膜-鞏膜組織，用角膜剪從赤道部到視乳頭放射狀剪開5～6刀(避開激光斑)，將RPE-脈絡膜-鞏膜復合體平鋪在載玻片上，滴加VECTASHIELD@Mounting Medium水溶性封片劑，加蓋玻片，熒光顯微鏡下拍攝CNV圖片，ImageJ軟件(版本號1.52a)測量CNV的面積。

2.5免疫熒光觀察巨噬細胞時間和空間分布 各組分別于造模后1、3、7和14 d檢測CNV 病灶處M1和M2型巨噬細胞，在上述時點取小鼠眼球經固定、梯度脫水、包埋后行冰凍切片，厚度6 μm，選取脈絡膜新生血管病灶最大處切片行熒光染色，將F4/80分別與iNOS、CD206共染，經打孔、封閉、孵育Ⅰ和Ⅱ抗，復染核后滴加抗淬滅劑加蓋玻片，在熒光顯微鏡/共聚焦顯微鏡下觀察M1和M2 巨噬細胞的時空分布，計數20倍鏡下CNV病灶周圍M1和M2型巨噬細胞，計算M2/M1比例。

2.6RT-qPCR檢測M1、M2型巨噬細胞極化相關分子標志物 各組分別于造模后第3天摘取眼球，3只眼球為一組，顯微鏡下冰上操作小心去除結締組織和肌肉，去除前節，分離RPE-脈絡膜-鞏膜組織，加入1 mL TRIzol，超聲波充分破碎組織后，提取總RNA?？俁NA逆轉錄合成cDNA，以其為模板進行RT-qPCR。各基因特異引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s，57 ℃退火及延伸30 s，循環40次。熔解曲線溫度65～95 ℃。以β-actin為內參照，對各個基因相對表達量進行計算。

2.7ELISA檢測病灶局部炎癥因子及VEGF的改變 各組分別于造模后第1和3天摘取眼球，3只眼球為一組，顯微鏡下冰上操作小心去除結締組織和肌肉，去除前節，分離RPE-脈絡膜-鞏膜組織。將組織放入200 μL RIPA與PMSF(100∶1)的混合液中，超聲波充分破碎組織后，提取總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度，按照ELISA試劑盒說明測定炎癥因子(IL-6、TNF-α和ICAM-1)及VEGF的濃度。

表1 RT-qPCR引物Table 1. Primers of RT-qPCR

3 統計學處理

本研究中定量資料數據以均數±標準差(mean±SD)表示[CNV面積以均數±標準誤(mean±SEM)表示]，FFA滲漏程度使用卡方檢驗，CNV的面積、極化巨噬細胞及炎癥因子的改變使用獨立樣本t檢驗分析，采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 尼古丁增加CNV的大小和滲漏

造模7 d后FFA結果表明，實驗組和對照組的滲漏分數分別為3.31±0.93和2.97±0.94，差異具有統計學意義(2=6.07，P<0.05)，見圖1、表2。尼古丁明顯加重CNV滲漏程度，相比于對照組(31.25%)，實驗組重度滲漏率(56.25%)明顯增加(2=4.06，P<0.05)，見表3。造模7 d后，ImageJ軟件測量CNV面積，實驗組為(17 569.96±1 444.00) μm2，對照組為(10 158.63±711.00) μm2，尼古丁可顯著促進CNV的發展(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. Representative images of laser spot fluorescein leakage. Seven days after laser injury, CNV leakage was imaged with fluorescein fundus angiography. Image were taken at 1 and 5 min after intraperitoneal injection of fluorescein sodium.
圖1 激光斑熒光素滲漏代表圖片

表2 第7天激光斑熒光素滲漏情況Table 2. Laser spot fluorescein leakage on day 7

2=6.07.*P<0.05vscontrol group.

表3 第7天激光斑熒光素重度滲漏與非重度滲漏情況Table 3. Severe and non-severe leakage of laser spot fluorescein on day 7

2=4.06.*P<0.05vscontrol group.

Figure 2. Nicotine aggravated CNV in mice. Mean±SEM.n=8.*P<0.05vscontrol group. Scale bars=50 μm.
圖2 尼古丁加重CNV的發展

2 尼古丁增加M2型巨噬細胞的浸潤

造模后1、3、7及14 d，F4/80和CD206免疫熒光雙染結果表明,M2型巨噬細胞早期出現，逐漸增加，第7天達到高峰，隨后緩慢下降，表現為早期低晚期高的時間變化趨勢；并且由病灶外圍，逐漸向病灶中央浸潤，表現出由外到內的空間分布規律，表明尼古丁可明顯增加M2型巨噬細胞的浸潤,見圖3。造模后1、3、7及14 d，F4/80和iNOS免疫熒光雙染結果表明，M1型巨噬細胞早期高，第3天為高峰，隨后逐漸減少，表現為早期高晚期低的時間變化趨勢，見圖4。通過計數發現尼古丁主要增加M2型巨噬細胞的浸潤，同時升高M2/M1的比率，改變巨噬細胞極化平衡，從而促進CNV的生長(P<0.05)，見圖5。

Figure 3. Spatiotemporal expression of M2-type macrophages around CNV lesions. Immunofluorescent F4/80 and CD206 double staining of CNV sections on 1, 3, 7, and 14 d after laser photocoagulation. Green indicates F4/80, red indicates CD206 and blue indicates DAPI-stained cellular nuclei. F4/80+/CD206+M2-type macrophages (white arrows) were detected in CNV sections. Scale bars=20 μm.
圖3 CNV病灶周圍M2型巨噬細胞的時空表達

Figure 4. Spatiotiemptoral expression of M1-type macrophages around CNV lesions. Immunofluorescent F4/80 and iNOS double staining of CNV sections on 1, 3, 7, and 14 d after laser photocoagulation. Green indicates F4/80, red indicates iNOS and blue indicates DAPI-stained cellular nuclei. F4/80+/ iNOS+M1-type macrophages (white arrows) were detected in CNV sections. Scale bars=20 μm.
圖4 CNV病灶周圍M1型巨噬細胞的時空表達

Figure 5. Changes of the number and proportion of the macrophages with immunofluorescence staining. Blinded cell counting was performed by two separate observers for each image. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
圖5 巨噬細胞個數及比例的變化

3 尼古丁促進巨噬細胞相關分子標志物mRNA的表達

造模后第3天RT-qPCR結果表明，尼古丁組M2相關的分子標志物(Ccl-2、CD163和CD206)mRNA的表達量較對照組顯著升高(P<0.05),但是M1相關的分子標志物(Cxcl-10、Cxcl-11和iNOS)mRNA的表達量兩組間并無顯著差異，見圖6。

Figure 6. RT-qPCR analysis for M2-related and M1-related marker mRNA expression in RPE-choroid-sclera complexes 3 d after laser photocoagulation. M2-related markers included Ccl-2, CD163 and CD206; M1-related markers included Cxcl-10, Cxcl-11 and iNOS. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group.
圖6 各類巨噬細胞標志物mRNA的表達

4 尼古丁促進炎癥因子和VEGF的表達

ELISA結果表明，造模后早期(第1天和第3天)，相對于對照組，尼古丁要明顯促進炎癥因子和VEGF的表達(P<0.05)，見圖7。

Figure 7. Nicotine promoted the secretion of inflammatory factors and VEGF. One and three days after laser injury, the concentrations of inflammatory factors (IL-6, TNF-α and ICAM-1) and VEGF in RPE-choroid-sclera complexes CNV mice were detected by ELISA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
圖7 尼古丁促進炎癥因子及VEGF的分泌

討 論

AMD是一個基因和環境共同作用的多因素疾病，許多危險因素包括衰老、家族史、糖尿病、高血壓、體重指數、吸煙和飲酒都與AMD的發生和發展密切相關[12]。大量的臨床研究表明在眾多危險因素中吸煙是最重要的可修正危險因素，香煙中4 000多種有毒物質中，尼古丁被認為是最有力的促血管損傷病理反應物質[5]。一項對4 439居民長達20年的縱向隨訪研究證實吸煙不僅增高人群中AMD的患病率，而且使晚期CNV的發生率明顯上升[13]。Lechanteur等[14]的研究也證實吸煙不僅使AMD患者的發病年齡提前，而且吸煙者發生CNV的幾率比不吸煙者高2～4倍，且與年吸煙量密切相關。同時尼古丁可以阻斷雷珠單抗(ranibizumab，Lucentis?)抑制CNV的效應，使吸煙的CNV患者抗VEGF療法的療效明顯降低[15]，這或許從一定程度上解釋了為何臨床中部分患者對抗VEGF療法不敏感的原因。目前對尼古丁的病理作用研究主要在促進腫瘤新生血管上，但尼古丁促進CNV的確切機制目前并不清楚。

我們的實驗表明尼古丁不僅明顯增加了CNV的面積，同時加重CNV的滲漏程度，這與先前的研究結果是一致的[16]。CNV是病理性脈絡膜的新生血管長入視網膜下腔，由于新生血管通透性高導致視網膜下出血和滲出物沉積使視細胞變性壞死從而造成90%AMD患者永久性視力喪失[17-18]。脈絡膜新生血管的病理機制是血管生成,血管生成是一個復雜的病理過程，包括細胞外基質變性，內皮細胞的遷移、增殖、管腔形成和血管壁的重構，該過程由促新生血管因子和抗新生血管因子的平衡所決定[19]。而尼古丁作為一種天然存在的促新生血管物質，最早在腫瘤和動脈粥樣硬化的研究中被發現。Heeschen等[20]發現，尼古丁可以通過血管內皮細胞表面的N型乙酰膽堿受體發揮強效促血管生成作用，從而促進腫瘤生長和動脈粥樣硬化的形成。

Pons等[21]的實驗表明尼古丁能通過結合色素上皮細胞表面N型乙酰膽堿受體的β1和α4亞基促進VEGF分泌而抑制色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)分泌，上調VEGF/PEDF比率，從而打破促新生血管因子和抗新生血管因子的平衡，加重CNV生長。但添加尼古丁受體阻滯劑后，CNV的生長并沒有完全被抑制[16]，這說明尼古丁還通過其它機制促進CNV生長。許建英等[22]的研究結果表明香煙提取物可明顯通過NF-κB通路刺激巨噬細胞來源的ICAM-1，后者是巨噬細胞促進新生血管的重要因子。我們的研究表明尼古丁可以增加巨噬細胞的浸潤，促進巨噬細胞向M2型極化，從而升高M2/M1的比率。巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，局部組織損傷后釋放趨化因子，引導外周血中單核細胞向損傷部位聚集，并且活化為巨噬細胞，巨噬細胞具有高度的可塑性，在不同微環境中可分化為功能不同的表型，稱為巨噬細胞極化[23]。極化的巨噬細胞在炎癥反應、損傷修復、血管生成等病理過程中扮演著重要角色。通常將巨噬細胞分為經典活化型(M1型)和選擇活化型(M2型)，二者代表巨噬細胞的兩個極端，M1型巨噬細胞抑制血管生成，而M2型巨噬細胞促進新生血管形成，即M2/M1的比例決定新生血管的形成[24]。我們的研究表明尼古丁可以影響巨噬細胞的極化平衡，形成M2High/M1Low的促血管形成模式。此外免疫熒光的結果提示，CNV病灶中M2型巨噬細胞早期就已出現，并且緩慢上升，直至第7天達到高峰，第7～14天則恢復至基線水平。這與激光誘導小鼠CNV在第3天開始出現，第7天明顯生長相符合，提示M2型巨噬細胞在CNV的整個發展過程中發揮作用，并在中晚期CNV的持續發展中發揮重要作用，這與Yang等[3]的研究結果一致。

巨噬細胞促進新生血管是通過VEGF、ICAM-1和TNF-α等一系列細胞因子實現的[25]。RPE細胞的損傷在CNV的發病過程中發揮重要作用，損傷的RPE細胞可以分泌前列腺素E2誘導巨噬細胞移行，并分化為M2型巨噬細胞?；罨腗2型巨噬細胞可影響內皮細胞、RPE細胞產生ICAM-1、TNF-α和VEGF等細胞因子，改變病灶局部的炎癥微環境，進一步促進血源性巨噬細胞的移行浸潤，形成惡性循環，而內皮細胞、RPE細胞為中后期VEGF的主要來源細胞，促進CNV中后期的發展。ICAM-1高表達于血管內皮細胞和RPE細胞表面，是細胞識別的重要分子，介導巨噬細胞的粘附與移行[26]。TNF-α具有調節炎癥、增殖、細胞毒性的多種作用，可以促進VEGF和單核細胞趨化蛋白-1等促血管生成因子的表達[27]，而我們的實驗表明尼古丁通過增加M2型巨噬細胞的浸潤，促進ICAM-1和TNF-α等的炎癥因子分泌，這說明尼古丁可以通過調控巨噬細胞極化而增加ICAM-1和TNF-α等炎癥因子的分泌，從而改變病灶周圍炎癥微環境，增加VEGF的分泌?；罨腗2型巨噬細胞是早期VEGF的重要來源，并且通過分泌IL-8和IL-10等細胞因子作用于RPE細胞和血管內皮細胞，促進其產生更多的VEGF，推動中晚期CNV的發展[28-29]。我們的實驗通過ELISA檢測激光后早期(第1、3天)CNV病灶周圍的VEGF蛋白水平，發現尼古丁刺激可以明顯增加早期VEGF的分泌，我們推測尼古丁刺激早期激光斑周圍浸潤的血源性巨噬細胞向M2型極化，促使早期VEGF的分泌增加，促進CNV早期的生長。

綜上所述，我們的實驗表明了尼古丁能夠通過促進M2型巨噬細胞的極化，形成M2High/M1Low的促新生血管形成模式，進而上調炎癥因子(IL-6、TNF-α和ICAM-1)及VEGF的表達和翻譯，最終加重激光誘導小鼠CNV的發展。我們的研究結果提示巨噬細胞極化介導的炎癥在CNV的發展中發揮重要作用，這在一定程度上解釋了臨床吸煙的AMD患者單純抗VEGF療法不敏感的原因，也為這類患者的治療提供了新思路和新策略。巨噬細胞極化發生在CNV早期，調控巨噬細胞極化有望從源頭控制促血管生成因子的表達及由此觸發的CNV，為針對巨噬細胞的靶向治療提供理論依據。但是小鼠CNV模型的病理過程與人類AMD并不完全相同，因此，還需進一步在人體中驗證該機制的確切性。