胍基乙酸對(duì)錦江黃牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

辛均平， 李美發(fā)， 王江北， 丁鵬舉， 王世輝， 柏 峻， 趙二龍， 瞿明仁， 許蘭嬌

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/飼料工程研究中心，江西南昌330045）

目前胍基乙酸作為一種優(yōu)質(zhì)的飼料添加劑和食品補(bǔ)充劑被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)和人類保健。胍基乙酸能夠在酶的作用下內(nèi)源性的合成肌酸。肌酸是一種含氮氨基酸， 被認(rèn)為是一種能量緩沖劑，主要作用是在肌酸激酶（CK）的作用下形成磷酸化肌酸（PCr），參與三磷酸腺苷（ATP）循環(huán)。 當(dāng)ATP 供能不足的瞬間， 磷酸肌酸通過(guò)肌酸激酶以非常快的速度將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到二磷酸腺苷中（ADP）重新轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷（R P B 等，2016）。額外添加胍基乙酸， 使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移物質(zhì)（磷酸肌酸），從而為肌肉、大腦、性腺等組織等高效工作提供動(dòng)力， 促進(jìn)能量源源不斷地向肌肉組織中分配（Wyss 等，2000）。 胍基乙酸在豬和禽類中的研究報(bào)道較多（張俊玲等，2016；王亞瓊等，2016；祁永旺等，2011），均有顯著提高生長(zhǎng)性能，改善肉質(zhì)等效果，但在反芻動(dòng)物中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。 本試驗(yàn)旨在探究胍基乙酸對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵功能的影響， 并為以后研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 胍基乙酸 胍基乙酸由北京君德同創(chuàng)農(nóng)牧科技股份有限公司提供，純度≥99%。

1.1.2 發(fā)酵底物 發(fā)酵底物由稻草、麥麩、豆粕等組成，將飼料原料充分研磨過(guò)1 mm 篩，底物按照精粗2：8 進(jìn)行混勻配置。 發(fā)酵底物干物質(zhì)按照烘箱干燥法進(jìn)行測(cè)定。

1.1.3 體外瘤胃發(fā)酵技術(shù)與瘤胃緩沖液 體外瘤胃發(fā)酵技術(shù)參照Menke 等（1979）方法進(jìn)行。 瘤胃緩沖液的配制： 組分見(jiàn)表1。 按順序依次添加400 mL 水、0.1 mL A 液、200 mL B 液、200 mL C液、1 mL D 液、40 mL E 液， 混合均勻后通入CO2直至溶液為無(wú)色透明，調(diào)整溶液pH 為6.80，使用前39 ℃預(yù)熱。

表1 人工唾液組成成分

1.1.4 瘤胃液采集 試驗(yàn)選取3 只健康、2 歲左右、體重為（200 ～250）kg、安裝瘤胃瘺管的錦江黃牛。在試驗(yàn)前一周飼喂相同日糧，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。 于晨飼前2 h 通過(guò)瘺管進(jìn)行瘤胃液的采集，每頭采集0.5 L 瘤胃液，裝入保暖瓶中混合均勻，迅速返回實(shí)驗(yàn)室用四層紗布過(guò)濾。

表2 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.1.5 體外發(fā)酵液的配置 將人工唾液和瘤胃液采取2∶1 的比例充分混合，持續(xù)通入CO2，整個(gè)過(guò)程在39 ℃水浴鍋中進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 準(zhǔn)確稱量500 mg 發(fā)酵底物于150 mL 發(fā)酵瓶中， 各組分別加入0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的胍基乙酸，每組5 個(gè)重復(fù)。 迅速往發(fā)酵瓶中加入60 mL 體外發(fā)酵液并通入CO2，將其置于恒溫（39 ℃）搖床發(fā)酵24 h。

1.3 指標(biāo)測(cè)定 發(fā)酵24 h 后將發(fā)酵瓶置于冰水浴中，終止發(fā)酵，使用便攜式pH 計(jì)立即測(cè)定pH。將發(fā)酵液用四層紗布過(guò)濾， 分裝離心管用于測(cè)定氨態(tài)氮（NH3-N）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、微生物蛋白（MCP）。 紗布中的殘?jiān)M(jìn)行回收用于測(cè)定干物質(zhì)消化率。

1.3.1 氨態(tài)氮（NH3-N） 的測(cè)定 參考馮宗慈等（1993）利用比色法測(cè)定氨態(tài)氮（NH3-N）。

1.3.2 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測(cè)定 以2－乙基丁酸為內(nèi)標(biāo)采用氣相色譜法測(cè)定， 取2 mL 瘤胃發(fā)酵液5000 g 離心10 min， 取上清液1 mL 置于2 mL 離心管中，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液，混勻置于4 ℃冰箱過(guò)夜。 第2 天取出后10000 g 離心10 min，取上清液置于測(cè)樣瓶中，采用安捷倫7890B 型號(hào)氣相色譜儀測(cè)定發(fā)酵液中總揮發(fā)性脂肪酸（ TVFA） 和各種揮發(fā)性脂肪酸含量。 測(cè)定條件：檢測(cè)室溫度220 ℃，柱溫180 ℃，氣化室溫度200 ℃，高純氮?dú)庾鳛檩d氣，壓力90 kPa，總流量為37.2 mL/min，空氣流量400 mL/min，氫氣流量40 mL/min，吹掃流量3 mL /min，分流比50∶1，線速度為23.4 cm/s。

1.3.3 干物質(zhì)消化率的測(cè)定

干物質(zhì)消化率/%=（1- M2/M1）×100。

式中：樣品重量為M1，g；體外消化后殘?jiān)亓繛镸2，g。

1.3.4 微生物蛋白（MCP）的測(cè)定 MCP 采用考馬斯亮藍(lán)法（Zinn 等，1986），應(yīng)用752 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理后， 利用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ one-wayANOVA），當(dāng)差異顯著時(shí)，采用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P ≤0.05 為差異顯著。 回歸分析采取多元回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 胍基乙酸添加量對(duì)發(fā)酵液pH、NH3-N、MCP、干物質(zhì)消化率的影響 由表3 可知，隨著胍基乙酸添加量的增加， 產(chǎn)氣量顯著提高 （P ＜0.05），其中0.4%添加組提高了40.82%。胍基乙酸添加組pH 顯著低于空白對(duì)照組（P ＜0.05），其中0.2%添加組顯著低于其他組（P ＜0.05）。 氨態(tài)氮（NH3-N） 濃度隨著添加劑量的增加先降低后升高， 其中添加0.1%、0.2%兩組顯著低于空白對(duì)照組（P ＜0.05）。瘤胃微生物蛋白含量隨著胍基乙酸添加量的增加而增加，其中0.4%添加組顯著提高了1.41%（P ＜0.05）。 干物質(zhì)消化率（IVDMD）隨著胍基乙酸添加量的增加具有增加的趨勢(shì)， 其中0.4%添加組顯著提高了11.24%（P ＜0.05）。

表3 胍基乙酸添加量對(duì)發(fā)酵液pH、氨態(tài)氮、MCP、干物質(zhì)消化率的影響

2.2 胍基乙酸添加量對(duì)發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響 由表4 可知， 胍基乙酸添加組的揮發(fā)性脂肪酸總量呈上升趨勢(shì)，0.4%添加組顯著高于空白對(duì)照組（P ＜0.05），提高了6.58%。 乙酸、丙酸、丁酸含量均是胍基乙酸添加組有上升趨勢(shì)，并且0.4%添加組顯著高于空白對(duì)照組 （P ＜0.05），其中丙酸提高了9.08%。 乙酸/丙酸各組無(wú)顯著差異（P ＞0.05），但0.4%添加組的乙酸/丙酸最低，比空白對(duì)照組降低了4.34%。

表4 胍基乙酸添加量對(duì)發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸的影響

3 討論

3.1 胍基乙酸添加量對(duì)發(fā)酵液pH、產(chǎn)氣量和干物質(zhì)消化率的影響 瘤胃pH 是衡量整個(gè)發(fā)酵過(guò)程是否處于正常環(huán)境的指標(biāo)，瘤胃正常pH 為5.5～7.5 （Calsamiglia 等，2002）， 本試驗(yàn)各組發(fā)酵液pH 均在正常范圍內(nèi)，且胍基乙酸組顯著低于空白對(duì)照組。 體外發(fā)酵產(chǎn)氣的氣體主要包括CO2、H2、CH4。 氣體是由飼料通過(guò)微生物發(fā)酵后產(chǎn)生的，Menke 等（1979）通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，飼料樣品在體外發(fā)酵24 h 后的產(chǎn)氣量與瘤胃內(nèi)有機(jī)物的消化率呈顯著的正相關(guān)。 本試驗(yàn)產(chǎn)氣量隨添加量的增加有上升的趨勢(shì)，與干物質(zhì)降解率的趨勢(shì)相吻合。其中0.4%添加量的產(chǎn)氣量和干物質(zhì)降解率均為最高。說(shuō)明胍基乙酸的添加能夠促進(jìn)瘤胃體外發(fā)酵。3.2 胍基乙酸添加對(duì)發(fā)酵液NH3-N、微生物蛋白（MCP）的影響 NH3-N 是瘤胃中的非蛋白氮化合物分解的終產(chǎn)物，也是瘤胃微生物合成MCP的主要原料。 瘤胃內(nèi)最佳NH3-N 含量為0.35 ～29.00 mg/dL（Owens 等，1983）。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，NH3-N 濃度為5.54 ～7.12 mg/100 mL， 均處于正常范圍內(nèi)。 微生物蛋白質(zhì)（MCP）是反芻家畜小腸可消化蛋白質(zhì)的一個(gè)重要組成部分， 也是評(píng)定飼料可發(fā)酵養(yǎng)分利用效率的重要指標(biāo)，MCP 合成效率的高低主要取決于瘤胃中碳源和氮源比例是否適宜，本試驗(yàn)結(jié)果表明，胍基乙酸組MCP 濃度隨添加量的增加呈顯著上升趨勢(shì)，其中MCP 濃度最高組所對(duì)應(yīng)的NH3-N 濃度也為最高值，說(shuō)明添加胍基乙酸能夠提高M(jìn)CP 的合成，促進(jìn)非蛋白氮的分解。

3.3 胍基乙酸添加對(duì)發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸的影響 TVFA 是反芻動(dòng)物的主要能量來(lái)源， 其具備貯存能量和維持瘤胃正常環(huán)境等功能。 丙酸是反芻動(dòng)物體內(nèi)糖異生的主要前體物質(zhì)， 且丙酸發(fā)酵時(shí)可以利用氫氣，使甲烷產(chǎn)量減少，能量轉(zhuǎn)化效率提高（Guilloteau 等，1986）。 乙酸/丙酸值可反映瘤胃發(fā)酵類型，其值越小，丙酸比例越高，飼料能量利用率也相應(yīng)越高。 本試驗(yàn)結(jié)果表明， 胍基乙酸添加組丙酸含量有上升的趨勢(shì)且乙酸/丙酸有下降的趨勢(shì)， 其中0.4%添加組的丙酸含量最高、乙酸/丙酸值最低，說(shuō)明胍基乙酸的添加顯著改善了瘤胃發(fā)酵類型。

4 結(jié)論

胍基乙酸添加可以改善瘤胃內(nèi)環(huán)境， 促進(jìn)底物的降解，提高NH3-N 和MCP 濃度，影響瘤胃發(fā)酵模式，并且與胍基乙酸添加量的增加呈正相關(guān)。