基于QuEChERS-HPLC-MS/MS 的禽飼料多殺蟲劑殘留檢測技術的研究

林 緒， 藍夢哲， 李金連， 王海鳴， 曹小彥

（廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東廣州510000）

殺蟲劑在農業生產過程中有著至關重要的作用，其可以促進高產、高效的現代化農業發展，滿足人們在農業生產過程中的需求（Zheng，2013）。近年來，各種新型殺蟲劑不斷的研制成功，并被廣泛的應用于替代傳統高毒高殘留殺蟲劑， 但隨著人們超量使用和不合理使用，造成了環境的污染，并經過禽飼料進入禽類養殖食物鏈中 （Nag 等，2011；Aulakh 等，2010）。 因此，檢測飼料中殺蟲劑殘留意義重大。

目前， 殺蟲劑殘留的分析方法主要有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）（李亞麗等，2017；吳劍平等，2017；高林等，2016；林仙軍等，2009）和氣相色譜-質譜法（GC-MS）（李永剛等，2009）。主要的前處理方法有液液分配萃取結合填充柱凈化和固相萃取 （SPE） 凈化 （邱霞琴等，2016；邢宇，2016）。液液分配萃取法需要消耗大量溶劑；填充柱凈化耗時耗力，步驟繁瑣，不適于大批量樣品的分析；SPE 凈化過程復雜且價格偏高。QuEChERS 是一種快速簡便、價格低廉、環境友好的預處理方法， 是實驗室大規模樣品處理的理想方法，有較高的實際應用價值（趙祥梅等，2008）。禽飼料中含有蛋白質、 油脂及少量色素等成分（Swiatkiewicz 等，2014）， 這些成分可能會影響對目標物的分析，因此，在檢測過程需要通過填料進行凈化前處理， 樣品的萃取凈化和農殘目標物的富集是實現準確分析的前提。 本文擬建立一種QuEChERS 分散萃取凈化、 基質配標并以外標法定量的液相色譜串聯三重四級桿質譜儀測定禽飼料中59 種殺蟲劑殘留的測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 Nexera X2 液相色譜儀（日本島津公司）；Triple Quad 4500 串聯質譜儀（配電噴霧離子源）；Analyst Software 儀器控制及數據處理軟件（美國AB Sciex 公司）。

59 種殺蟲劑標準品（純度≥99%）均購于德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲酸和乙腈（質譜級，作為流動相）、乙腈（色譜純，作為前處理）、乙酸（優級純）、乙酸銨、N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）和無水硫酸鎂（分析純）、固相萃取柱（規格為0.3 g/3mL 的PSA、C18 和ALN）均購于德國CNW 公司。

飼料為市場購買， 粉碎至完全通過0.45 mm篩孔，充分混合，備用。

1.2 標準溶液的配制 準確稱取各殺蟲劑標準品10 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL 容量瓶中，以乙腈定容，配制成1000 mg/L 的標準儲備液；用乙腈稀釋標準儲備液，配制成5 mg/L 的標準中間液，于-18 ℃儲存；用乙腈將標準中間液配制成各濃度的混合標準工作液，于4 ℃儲存。

1.3 樣品前處理 準確稱取飼料樣品約5 g，置于50 mL 聚乙烯離心管中，用5 mL 超純水浸泡5 min，加入20 mL 1%（V/V）乙酸酸化乙腈和5 g 氯化鈉，渦旋，振蕩提取，以4000 r/min 離心5 min，使之分層，提取液備用。 取4 mL 提取液，加入復合（0.3 gC18+0.3 gALN）QuEChERS 分散萃取填料中，渦旋凈化，8000 r/min 離心3 min。 取1 mL 凈化液過0.22 μm 微孔濾膜，待測進樣分析。

1.4 HPLC-MS/MS 條件 色譜柱：Venusil MP C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫: 40 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.4 mL/min；流動相：（A）0.1%（V/V）甲酸水溶液和（B）乙腈。 梯度洗脫條件：0 ～2.00 min，10%B；2.00 ～4.00 min，90%B；4.00 ～5.00 min，90%B ～10%B；5.00 ～6.00 min，10%B。

離子源：電噴霧電離（ESI）源；掃描方式：正離子、負離子交替掃描；檢測方式：MRM 模式；氣簾氣流速：30 L/min；霧化氣流速：50 L/min；輔助加熱氣流速：50 L/min；碰撞氣：中等強度（medium）；輔助加熱氣溫度：500 ℃；噴霧電壓：5000 V（ESI+）/-4500 V（ESI-）。 定性離子對、定量離子對、碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）、碰撞室入口電壓（EP）和碰撞室出口電壓（CXP）見表1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化 質譜條件的優化主要包括選擇各化合物的母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量等。取20 μg/L 的殺蟲劑混合標準溶液，用針泵進樣的方式， 首先進行母離子掃描（Q1 scan），獲取待測物的母離子，然后通過子離子掃描獲取其碎片離子， 最后用MRM 模式掃描的方式優化各質譜參數，優化結果見表1。 加標飼料樣品（20 μg/kg）中59 種殺蟲劑的總離子流色譜圖見圖1。

表1 59 種殺蟲劑的質譜參數

注：*定量離子。

2.2 QuEChERS 方法的優化

2.2.1 提取劑的優化和選擇 禽飼料中含有蛋白質、 油脂及少量色素等成分， 直接用有機溶劑提取，會產生嚴重的基質效應，并且干制的禽飼料，其含水量少， 不利于目標化合物農殘的提取。 因此， 在加入有機溶劑之前， 需要加入適量的水浸泡，以改善提取效果。此外，研究表明，乙酸和乙酸銨的加入能夠防止對酸堿性敏感的有機磷酸酯類和氨基甲酸酯類殺蟲劑的降解 （Payá 等，2007；Lehotay 等，2005）。 因此，實驗比較了不同提取劑（乙腈、1%（V/V）乙酸乙腈、乙腈+乙酸銨（20 mL+1g）提取時，加標禽飼料樣品（異柳磷、毒死蜱、滅菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷為0.200 mg/kg，其他殺蟲劑為0.020 mg/kg）中59 種殺蟲劑的加標回收率，其分布情況見圖2。 由圖2 可知，1%（V/V）乙酸乙腈作為提取劑時，禽飼料中59 種殺蟲劑的加標回收率在70% ～120%的殺蟲劑有39種，基本滿足要求，因此以此作為提取劑。

2.2.2 QuEChERS 吸附劑和用量的選擇 禽飼料的成分可能會影響對目標物的分析，因此，在檢測過程中需要通過填料進行凈化前處理。 凈化方式包括固相萃取（邱霞琴等，2016）和QuEChERS 分散萃取（姚芳等，2017；姜光麗等，2015；魯紅等，2012），國內相關研究起初主要以PSA 單一的填料作為凈化劑， 主要的檢測項目以氨基甲酸酯類殺蟲劑為主（董靜等，2008），可有效去除脂肪酸和有機酸；C18 填料對非極性的組分具有吸附作用，能有效去除低極性雜質和高級脂肪酸酯類等大分子基質干擾物，對少量色素也具有吸附作用；中性氧化鋁對油脂有較強的凈化效果。因此，本實驗分別對比了3 種（PSA、C18 和ALN）吸附劑固相萃取和分散萃取對禽飼料的凈化效果 （王思威等，2018；Lehotay 等，2005）， 旨在找出一種禽飼料中59 種殺蟲劑較好的凈化填料。

當禽飼料中異柳磷、毒死蜱、滅菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷加標量為0.200 mg/kg，其他殺蟲劑為0.020 mg/kg 時， 分別研究了ALN、PSA和C18 不同固相萃取對殺蟲劑項目回收效果。 結果如圖3 所示，0.3 g/3mL 的C18 和ALN 固相萃取柱的凈化效果較好， 回收率在70% ～120%的殺蟲劑種類最多，近45 種，對回收率的影響最小。

然而，利用固相萃取柱凈化樣品時，其操作過程較繁瑣，且成本較高。因此，本實驗以異柳磷、毒死蜱、滅菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷加標量為0.200 mg/kg， 其他殺蟲劑為0.020 mg/kg 進行加標回收實驗， 考察QueChERS 分散萃取與固相萃取凈化效果，對比0.3 g C18、0.3 g ALN 以及復合（0.3 g C18+0.3 g ALN） 三種填料對禽飼料59種殺蟲劑回收率的影響。 由圖4 可知， 以0.3 g C18+0.3 g ALN 復合填料作為分散萃取凈化填料時，有44 種殺蟲劑回收率在70% ～120%，因此，復合（0.3 g C18+0.3 g ALN）分散萃取對于禽飼料中59 種殺蟲劑的凈化效果和回收率最佳。

2.3 基質效應 基質效應是指樣品中除了待測目標物外樣品基質中的一些共同提取物成分對待測物濃度或質量測定精確度的影響。 基質效應主要源自色譜分離過程中與被測物共流出的物質對被測物離子化過程的影響（鮑忠贊，2018；夏珍珍等，2016）。基質效應是在殺蟲劑殘留檢測時，分析復雜樣品基質需要考慮的重要問題之一。

本實驗通過溶劑配制標準和空白基質配制標準建立5 點校正曲線，以馬拉硫磷、克百威、胺菊酯、氟蟲腈、氟蟲脲和噻嗪酮分別作為有機磷類、氨基甲酸酯類、菊酯類、苯基吡唑類、苯甲酰脲類和雜環類殺蟲劑的代表物質，如圖5 所示，和氣相色譜-質譜聯用法不同，液相色譜-串聯質譜法的基質效應以抑制效應為主， 與相關文獻報道一致（謝家樹等，2008）。 基質效應不能被消除，但可以通過基質配標準工作曲線，對基質效應進行校正，相比傳統的溶劑配標準工作曲線，能提高回收率，且其定量準確性更高。

此外，經過基質曲線校正后，按照復合0.3 g C18+0.3 g ALN 分散萃取凈化， 以異柳磷、 毒死蜱、滅菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、特丁硫磷加標量為0.200 mg/kg，其他殺蟲劑為0.020 mg/kg 加標量進行加標回收實驗，其回收率分布情況如圖6 所示，回收率在80% ～100%的殺蟲劑為46 種，占比高達78%，對回收率的影響最小。 因此，利用復合0.3 g C18+0.3 g ALN 分散萃取這一優化條件對禽飼料進行凈化具有可行性。

因此， 為了消除禽飼料基質帶來的離子抑制效應對定量測定的影響， 需要用禽飼料空白樣品提取液配制系列基質標準工作液， 繪制標準曲線進行定量。

2.4 線性范圍、定量限、回收率和精密度 用空白禽飼料基質提取液按照1.3 中方法進行樣品前處理，配制異柳磷、毒死蜱、滅菌磷、醚菊酯、苯醚菊酯、 特丁硫磷曲線濃度為0.050、0.100、0.200、0.500、1.000、2.000 mg/L， 其他殺蟲劑為0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.2000 mg/L 的 混 合 殺蟲劑標準工作液， 在1.4 中條件下對59 種殺蟲劑進行分析測定。 以殺蟲劑的色譜峰面積對各目標化合物的質量濃度進行線性回歸。 結果表明，59種殺蟲劑在0.005 ～2.000 mg/L 范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.99。 以3 倍信噪比（S/N=3）的結果作為檢出限（LOD），結果表明，檢出限可達到0.004 ～0.040 mg/kg。 按照1.3 中樣品前處理， 向空白基質中分別加入低、 中、 高（0.020、0.200、0.040 mg/kg 和0.400 mg/kg、0.080 mg/kg 和0.800 mg/kg）3 個水平的混合標準溶液進行加標回收率的測定（n=3）。結果表明，59 種殺蟲劑RSD為4.0% ～10.5%， 禽飼料59 種殺蟲劑的三水平平均回收率為71.0% ～109.0%（表2）。

表2 禽飼料中59 種殺蟲劑的加標回收率、相對標準偏差和檢出限（n=3）

加標回收率/%殺蟲劑相對標準偏差/% 檢出限/(mg/kg)低濃度 中濃度 高濃度特丁硫磷亞砜 84.7 93.5 94.9 6.1 0.004 3-羥基克百威 90.3 90.0 79.1 7.4 0.004對硫磷 88.7 90.7 96.4 4.3 0.004氟蟲腈 105.0 98.0 103.4 3.6 0.004氟蟲腈砜 103.2 94.8 95.9 4.7 0.004氟蟲腈硫化物 104.2 97.8 101.3 3.2 0.004氟甲腈 88.5 102.4 99.3 7.5 0.004醚菊酯 74.5 92.3 96.0 13.1 0.04苯醚菊酯 75.3 88.3 80.0 8.1 0.04涕滅威砜 90.7 83.5 101.6 9.9 0.004涕滅威亞砜 87.0 80.9 95.2 8.2 0.004馬拉硫磷 86.5 86.4 96.3 6.3 0.004敵百蟲 92.7 89.8 95.0 2.8 0.004敵敵畏 91.3 87.1 96.8 5.3 0.004三唑磷 93.5 90.3 95.3 2.7 0.004特丁硫磷 85.5 86.9 91.1 3.0 0.04

2.6 實際樣品分析 隨機購買了市售鴿配合飼料、大雞配合飼料、蛋雞料、鵝配合飼料、蛋雞食槽料5 種禽飼料共20 份樣品，應用所建立分析方法進行殺蟲劑殘留含量測定。結果表明，阿特拉津檢出1 份，含量為0.011 mg/kg；多菌靈檢出1 份，為0.0070 mg/kg；毒死蜱檢出1 份，為0.027 μg/kg。同時對上述5 種禽飼料樣品進行異柳磷、毒死蜱、滅菌磷、 醚菊酯、 苯醚菊酯、 特丁硫磷加標量為0.200 mg/kg，其他殺蟲劑為0.020 mg/kg 水平的加標回收實驗，59 種殺蟲劑的回收率為71.0% ～109.0%，精密度（n=6）為4.0% ～10.5 %。

3 結論

本文建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS 測定禽飼料中59 種殺蟲劑殘留的方法， 該法簡便快速，使用溶劑少，靈敏可靠，有較強的針對性和適應性。該法提高了實驗室的檢測速率和檢測通量，為禽飼料中多種藥物殘留的例行檢測、 風險評估等研究，提供了一種高效可靠的分析手段。