DON暴露對斷奶仔豬小腦組織脂質過氧化反應、神經遞質分泌及鈣穩態的影響

朱 雷，曹 利，冉 夢，王中正,2， 陳曉芳，李 玉，馮士彬，吳金節，王希春

(1.安徽農業大學 動物科技學院，合肥 230036；2. 安徽省銅陵市農業委員會，安徽銅陵 244000)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，又名嘔吐毒素，主要是由禾谷鐮刀菌產生的一種B型單端孢霉烯[1]。據檢測報告數據顯示，2017年國內各省市區域的玉米、玉米副產物全價飼料等1 034個飼料原料及配合飼料樣品的DON超標率分別達到1.23%、6.67%及1.76%[2]。在另一調查中，全國21個省市檢測的659份飼料及飼料原料樣品中，霉菌毒素污染水平呈現出區域差異，整體受DON毒素污染最為嚴重[3]。以往的研究結果表明，DON對動物機體具有免疫毒性、神經毒性及細胞毒性等多種毒性作用[4]。有學者發現，DON暴露可以影響雛雞腦部的脂質過氧化水平，神經遞質分泌以及擾亂鈣穩態的平衡，此外，DON還可以改變雛雞腦部的形態結構[5-7]。另外其他研究表明，DON還可以影響體外培養仔豬海馬神經細胞的神經遞質分泌、改變脂質過氧化及鈣穩態的狀態[8-9]。低水平的DON可以影響豬腦脊髓液中多巴胺的濃度[10]，而高水平DON則可使初產豬皮質中5-羥色胺及下丘腦多巴胺濃度增加，同時減少下丘腦中去甲腎上腺素及腦橋中多巴胺的含量[11]。在小腦神經研究方面，也有學者發現DON可使斷奶仔豬小腦的部分神經遞質分泌異常[12]。目前，關于飼料中DON對斷奶仔豬神經毒性的研究大多集中在大腦組織及神經細胞的體外毒性方面，對小腦組織的研究較少。因此，本研究旨在通過斷奶仔豬DON體內暴露試驗，探索其對仔豬小腦組織的毒性作用，為進一步豐富和完善DON的神經毒性機理提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，由安徽省青陽縣五星畜牧種豬場提供。

1.2 主要試劑和儀器

禾谷鐮刀菌菌種由南京農業大學動物醫學院中毒病實驗室惠贈；多咪靜注射液，購自美國輝瑞制藥有限公司；ELISA試劑盒，均購自上海源葉生物科技有限公司；Ca2+測定試劑盒，購自北京利德曼生化股份有限公司；RIPA裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒，均購自碧云天生物技術研究所；β-actin抗體，購自北京銳抗生物科技有限公司；Calmodulin(CaM)、CaMKⅡ、CaMKⅡ(Phospho Thr305)抗體，均購自美國ImmunoWay；二抗購自碧云天生物技術研究所；Trizol RNA 提取試劑，購自大連寶生物工程有限公司；StarScriptⅡ First-strand cDNA Synthesis Mix，購自北京康潤誠業生物技術有限公司(GenStar)；SybrGreen q-PCR mastermix，購自廣州柏仕達新材料有限公司；PierceTMECL Western-blot Substrate，購自美國Thermo有限公司。

1.3 試驗動物的分組與飼養管理

選取15頭21日齡平均體質量為(6.87± 0.41)kg的臨床檢查健康的“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機分為3欄，每欄5頭，分別飼喂基礎飼糧(對照組)、低劑量DON飼糧(DON質量分數為1 mg·kg-1)、高劑量DON飼糧(DON質量分數為2 mg·kg-1)。試驗期為60 d。自由采食，自由飲水，每天觀察仔豬的采食和健康狀況，消毒免疫程序嚴格按照豬場管理方案進行。

1.4 樣品采集與處理

在第60天時，每欄選5頭仔豬，麻醉后經前腔靜脈放血致死，仔細剝離頭骨并迅速取出完整的腦，并置于冰上分離出小腦組織。取部分小腦組織加入一定量生理鹽水，置于冰上進行勻漿， 3 000 r·min-1離心10 min，取上清液保存于 -80 ℃冰箱內，用以檢測脂質過氧化指標、神經遞質含量及Ca2+濃度；剩余部分組織裝入凍存管，保存于液氮，用以檢測鈣調蛋白通路相關基因蛋白的表達情況。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 氧化與抗氧化性能指標的測定 分別用豬超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)ELISA檢測試劑盒進行測定，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.2 神經遞質及鈣離子濃度的測定 分別用豬5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、乙酰膽堿(ACH)和γ-氨基丁酸(GABA)ELISA檢測試劑盒及Ca2+測定試劑盒進行測定，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.3 qRT-PCR 法檢測組織中CaM和CaMKⅡmRNA基因相對表達水平 將組織樣本分別用液氮研磨粉碎，加入 1 mL Trizol試劑，在碎冰上進行勻漿處理，離心取上清液，加入500 μL酚氯仿，振蕩混勻，靜止5 min，置于離心機中，4 ℃離心10 min，取上清并加入700 μL異丙醇，混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，去上清，取白色沉淀，用φ=75%乙醇洗滌1次，置于超凈臺上風干，溶于50 μL DEPC處理水中，電泳檢測。用反轉錄試劑盒將提取的 RNA 反轉錄成 cDNA。根據GenBank中序列，運用Primer 5.0軟件設計目的基因和內參基因的特異性上、下游引物序列。相關基因的引物序列見表1。

表1 CaM、 CaMKⅡ 目的基因和 18S內參基因引物參數Table 1 Parameters of primer for CaM, CaMKⅡ and 18S genes

1.5.4 Western-blot法檢測組織中鈣調通路中相關蛋白的表達水平 稱取0.1 g凍存的小腦組織，加入1 mL RIPA裂解液，14 000 r·min-1離心10 min收集上清，備用。收集的上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照每孔蛋白總量為50 μg計算蛋白上樣量，分裝后的蛋白加入Loading Buffer(5×)，100 ℃水浴 5 min，存于4 ℃，備用。安裝膠板，配12%的分離膠及15%的濃縮膠，加樣后將電壓調至80 V開始電泳，待樣品跑至兩膠分界線時將電壓調至120 V，待樣品跑至膠板底部時終止電泳。隨后切下所需凝膠將條帶轉移至PVDF膜上。將印有蛋白的膜置于50 g·L-1的脫脂牛奶中，置于水平搖床上室溫孵育 4 h進行封閉。隨后4 ℃孵育一抗過夜。次日TBST清洗后，室溫孵育二抗 45 min，TBST清洗后滴加顯影液使用凝膠成像系統成像，并用Quantity one軟件對條帶進行灰度分析。

1.6 數據處理

試驗數據均以“平均值±標準差”表示，使用SPSS 20.0軟件中的ANOVA過程進行數據分析，多重比較采用LSD法；使用Adobe Photoshop CS4軟件合成圖片；柱形圖使用GraphPad Prism 5.0 軟件 制作。

2 結果與分析

2.1 仔豬小腦組織中脂質過氧化指標的檢測

由表2可見，與對照組相比，高劑量組SOD活性極顯著降低(P<0.01)，與低劑量組相比，高劑量組SOD活性顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，試驗組的GSH-Px活性均極顯著降低 (P<0.01)，且高劑量組極顯著低于低劑量組 (P<0.01)。與對照組相比，試驗組的NO濃度均極顯著升高(P<0.01)；與低劑量組相比，高劑量組NO濃度極顯著升高(P<0.01)。各組間MDA濃度無顯著差異(P>0.05)。

表2 DON對小腦中脂質過氧化指標活性的影響Table 2 Effect of DON on activities of lipid peroxidation indexes in cerebellum

注：同行進行相比，數據后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著但未達極顯著(0.010.05)。下同。

Note: In the same row of the different groups,the data with different superscripts of uppercase letters indicate significance atP<0.01,the data with different superscripts of lowercase letters indicate significance at 0.01

2.2 斷奶仔豬小腦組織中神經遞質及Ca2+濃度的檢測

由表3可知，與對照組相比，高劑量組5-HT濃度極顯著升高(P<0.01)，且高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)。各組間NE和GABA濃度無顯著性差異(P>0.05)。與對照組相比，試驗組DA含量均極顯著降低且呈劑量依賴型(P<0.01)。與對照組相比，試驗組ACH含量均極顯著降低(P<0.01)；與低劑量組相比，高劑量組ACH含量極顯著降低(P<0.01)。與對照組相比，試驗組鈣離子濃度均極顯著上升(P< 0.01)；與低劑量組相比，高劑量組鈣離子濃度呈極顯著上升(P<0.01)。

表3 DON對小腦中神經遞質及Ca2+濃度的影響Table 3 Effect of DON on concentrations of neurotransmitters and Ca2+ in cerebellum

2.3 仔豬小腦組織中鈣調通路相關基因mRNA表達量的影響

由圖1可知，高劑量組CaMmRNA表達量極顯著低于對照組和低劑量組(P<0.01)。與對照組相比，隨飼糧中DON含量的增加，仔豬小腦中CaMKⅡmRNA基因相對表達量均極顯著降低(P<0.01)。

2.4 DON對仔豬小腦組織中鈣調通路相關基因蛋白表達水平的影響

如圖2所示，高劑量組CaM蛋白水平極顯著低于對照組和低劑量組(P<0.01)，而高劑量組CaMKⅡ蛋白磷酸化水平極顯著高于對照組和低劑量組(P<0.01)。對照組與低劑量組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 DON對小腦中CaM和 CaMKⅡ mRNA 相對表達量的影響Fig.1 Effects of DON on relative expression of CaM and CaMKⅡ mRNA in cerebellum

C為對照組 C is control group；L為低劑量組 L is low dose group；H為高劑量組 H is high dose group

3 結論與討論

玉米為仔豬飼料中的重要成分之一，飼糧一旦保存不當，如遇到潮濕、高溫等環境，則極易產生DON。研究表明，DON對動物具有神經及細胞毒性作用，可使雛雞腦組織[7]及體外培養的仔豬海馬神經細胞[9]發生脂質過氧化及細胞損傷，本試驗使用的斷奶仔豬飼糧中DON質量分數為 1 mg·kg-1，該質量分數為國家標準中的最高限量，將其作為試驗低劑量組進行DON對斷奶仔豬小腦組織和細胞損傷作用的研究。

當動物出現氧化應激時，機體產生導致細胞和組織損傷的促氧化劑，與此同時，機體也將產生相應的抗氧化劑進行平衡，如SOD、GSH-Px等[13]。此外，NO也可通過細胞膜的脂質過氧化作用從而導致神經細胞的損傷，若NO含量過多最終會造成腦損傷[14]。本試驗中所檢測的MDA為脂質過氧化的最終產物，綜合以上指標可說明機體發生脂質過氧化的程度。研究表明，DON可使仔豬海馬細胞中SOD及GSH-Px含量顯著降低，而使MDA的含量極顯著升高[9]。此外，3 mg·kg-1DON可使斷奶仔豬血清中GSH-Px含量顯著降低[15]。在本試驗中，DON使斷奶仔豬小腦組織中GSH-Px及SOD顯著下降，而NO及MDA顯著升高，說明DON誘導仔豬小腦組織出現脂質過氧化現象，并對腦組織細胞產生一定毒性作用。

神經遞質為動物機體中傳導神經沖動的重要物質。其中ACH尤為重要，它可在突觸間進行傳遞，傳導神經沖動。有研究顯示，ACH在低濃度時，神經間的興奮傳遞被抑制，神經細胞的生長和分化均受到影響，從而導致神經系統的生長發育遲緩[16]。此外，DON導致動物產生嘔吐反應，可能是由于其作用在腸嗜鉻細胞(EC)細胞而誘導5-HT的局部釋放[17]。NE則對急性應激反應具有快速的反應，是交感神經腎上腺素的核心組成成分[18]。已有學者研究表明，DON可使豬下丘腦、額葉和小腦中引起NE及5-HT的增加和DA的減少[12]。同時還可使豬血清及腦部5-HT濃度的升高從而改變豬的攝食行為并出現拒食和嘔吐現象[19-20]。本試驗中斷奶仔豬小腦組織中5-HT含量顯著升高，而DA、ACH含量下降，說明DON影響仔豬小腦組織中各種神經遞質的分泌，對小腦的神經傳導產生一定影響，而NE并未出現顯著變化，說明長期飼喂含DON飼糧對斷奶仔豬機體產生慢性毒性作用而非急性。

在動物機體中，Ca2+是一種非常重要的物質，它可以調節神經遞質的釋放，影響細胞內鈣穩態。作為Ca2+釋放傳感器的CaM在腦中含量豐富[21]，過氧化氫酶(CAT)、SOD及大多數神經遞質的釋放過程均是受Ca2+與CaM結合所調控[22]。但Ca2+濃度較高則會產生細胞毒性，導致神經細胞凋亡和壞死[23]。此外，CaMKⅡ是一種多聚體絲氨酸—蘇氨酸激酶，為神經遞質釋放的必需物質[24]，其最初通過結合鈣化鈣調蛋白(Ca2+/CaM)激活，該蛋白質的磷酸化則有助于確定細胞膜的興奮性及細胞Ca2+穩態[25]。研究表明，DON可使體外培養的仔豬海馬細胞中Ca2+含量極顯著升高[9]。本試驗中，試驗組斷奶仔豬小腦組織中Ca2+含量上升，但CaM基因及蛋白的表達量均降低，同時CaMKⅡ磷酸化程度升高導致其基因與蛋白含量降低，說明DON對小腦的鈣穩態造成一定程度的影響，具有一定的神經毒性作用。

綜上所述，通過體內暴露試驗，DON可影響斷奶仔豬小腦組織脂質過氧化反應，改變神經遞質的分泌，同時擾亂鈣調通路相關基因與蛋白的表達水平，引起鈣穩態失衡。上述結果表明 DON可對仔豬產生一定的神經毒性作用。