老年H型高血壓患者頸動脈內膜中層厚度與MTHFR基因多態性的關系

王靜 陳勁 湯其強

(1安徽醫科大學附屬省立醫院神經內科，安徽 合肥 230001；2合肥市第二人民醫院老年科)

據統計，頸動脈粥樣硬化(AS)作為一種心血管疾病其患病率持續升高〔1〕。有研究指出，血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平與心腦血管疾病密切相關，Hcy水平升高，腦卒中發病風險升高，而血漿中Hcy降低后，心腦血管疾病的發生率顯著降低〔2,3〕。H型高血壓即伴有高Hcy血癥的原發性高血壓，已知高血壓和高Hcy血癥可協同增加患者并發心腦血管疾病的風險〔4,5〕。頸動脈內膜中層厚度(IMT)是臨床預測全身AS的主要指標，其在心腦血管事件的發生中具有很好的預測價值〔6〕。研究表明，血漿Hcy對動脈粥樣硬化和血栓形成具有促進作用〔7〕。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是Hcy分解代謝的關鍵酶，MTHFR基因缺陷導致酶活性異常，從而影響血漿Hcy水平〔8〕。MTHFR基因中677C/T位點具有多態性，其中677CT、TT型可導致Hcy水平升高。有研究指出，MTHFR基因C677T突變和動脈粥樣硬化形成有關〔9〕，但關于MTHFR基因與頸動脈內膜厚度的關系鮮有報道。本研究旨在探討老年H型高血壓患者IMT與MTHFR基因多態性的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年8月至2018年12月在合肥市第二人民醫院接受治療的274例高血壓患者作為高血壓組，其中男182例，女92例；年齡60～80歲，平均(68.03±7.35)歲；根據血漿Hcy檢測結果，將高血壓組分為H型高血壓組196例和非H型高血壓組78例；根據超聲檢查結果將H型高血壓組分為伴有IMT增加的H1組(88例)和無IMT增加的H2組(108例)兩個亞組。另選擇同期在合肥市第二人民醫院體檢的180位健康體檢者作為對照組。對照組男118例，女62例；年齡60～78歲，平均(70.43±7.29)歲。各組年齡、性別構成比較差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：高血壓患者均符合《中國高血壓防治指南(2010年)》中的診斷標準〔10〕。排除標準：①患有惡性腫瘤、甲狀腺疾病者、血液系統疾病；②近3個月內服用維生素B6、維生素B12、葉酸及其他影響血清Hcy水平者；③患有繼發性高血壓者如原發性醛固酮增多癥，腎動脈狹窄，腎實質性高血壓等。本研究經合肥市第二人民醫院倫理委員會批準。受試者均知情同意。

1.2方法

1.2.1樣本的采集 研究組入院第二日清晨采集患者靜脈血6 ml分為兩份，一份置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中搖勻，2 500 r/min離心5 min，分離上層血漿置于-80℃冰箱密封保存，分離中層白細胞于-80℃保存，檢測MTHFR基因多態性。一份室溫靜置20 min，2 500 r/min離心15 min，收集上層血清置于-80℃冰箱待檢。對照組于體檢時采集靜脈血6 ml，同上述處理方法一致分別收集血漿、血清、白細胞。

1.2.2生化指標的檢測 對上述所收集血清進行三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等生化指標的測定。所測指標均由專業檢驗科人員使用日本Hitch7600全自動生化分析儀檢測。

1.2.3血漿Hcy水平的檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿Hcy水平，檢測使用DG 3022A型酶聯免疫檢測儀，試劑盒購自北京九強生物技術有限公司。

1.2.4MTHFR基因多態性的檢測 提取各組研究對象白細胞中的基因組DNA，采用擴增阻滯突變系統-聚合酶反應(ARMS-PCR)擴增MTHFR C677T基因片段，根據NCBI查詢 MTHFR C677T的序列號設計引物，上游：5'-TGAAGAGAAGGTGTCTGCGGA-3'，下游：5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'，引物由北京閱微基因技術有限公司合成。PCR條件：94℃解鏈10 min；94℃變性45 s，62℃退火40 s、72℃延伸45 s，循環共計39個；72℃下延伸7 min。擴增產物經Hinf酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，隨后進行溴乙啶染色，并對DNA顯色條帶進行觀察和分析，判斷基因型。

1.2.5IMT的測定 應用美國ATL HDI-5000型彩色多普勒超聲診斷儀檢測頸動脈IMT，測量IMT，IMT<1.0 mm表示厚度正常，1.0 mm≤IMT<1.2 mm表示增厚，IMT≥1.2 mm表示斑塊形成。

1.3統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行方差分析、采用χ2檢驗；采用Spearman相關性分析，對影響IMT增厚的因素進行Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1各組一般資料和生化指標的比較 H1組、H2組、非H型高血壓組、對照組的年齡、性別、BMI、吸煙史均差異無統計學意義(P>0.05)；H型高血壓組Hcy水平顯著高于非H型高血壓組和對照組(P<0.05)，H1組Hcy水平顯著高于H2組(P<0.05)；H型高血壓組的高Hcy血癥比例顯著高于對照組和非H型高血壓組(P<0.05)，且H1組的高Hcy血癥比例顯著高于H2組(P<0.05)；H1組、H2組、非H型高血壓組IMT顯著高于對照組(P<0.05)，H1組、H2組IMT顯著高于非H型高血壓組(P<0.05)，H1組的IMT顯著高于H2組(P<0.05)；H1組、H2組、非H型高血壓組的TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較無顯著差異(P>0.05)，但三組TG、TC、LDL-C、HDL-C水平均顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組一般資料、生化指標的比較

與對照組相比:1)P<0.05；與非H型高血壓組相比:2)P<0.05；與H2組相比:3)P<0.05，表2同

2.2基因分型檢測結果 CC基因型長度為198 bp，無酶切位點；CT酶切后產生兩個片段，電泳帶分別為198 bp和175 bp；TT型酶切后產生2個片段，電泳帶顯示175 bp，2%瓊脂糖凝膠電泳顯影結果如圖1、圖2所示。

M為標記，1～12為CC基因型圖1 MTHFR基因C677C PCR擴增產物

2.3各組MTHFR C677T 基因型及等位基因頻率比較 四組CC、CT基因型無顯著差異(P>0.05)；H1組TT基因型頻率顯著高于H2組、非H型高血壓組和對照組(P<0.05)，其等位基因T頻率也顯著高于H2組、非H型高血壓組和對照組(P<0.05)；H2組TT基因型頻率顯著高于對照組，與非H型高血壓組無顯著差異(P>0.05)，其等位基因T也顯著高于對照組和非H型高血壓組(P<0.05)。見表2。

2、3、4、5、6、9為CT型；1、7、8為TT型，M為標記圖2 MTHFR基因C677T、T677T擴增產物

表2 各組MTHFR基因型及等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.4高血壓組MTHFR C677T基因型的Hcy水平和IMT的比較 在H1組、H2組中，不同MTHFR C677T基因型的Hcy水平和IMT比較均有顯著差異(P<0.05)，均表現為TT基因型的Hcy水平和IMT高于CT、CC基因型，CT基因型高于CC基因型；非H型高血壓組TT基因型的Hcy水平和IMT顯著高于CC基因型(P<0.05)，與CT基因型無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組不同基因型Hcy水平和IMT比較

與本組CC基因型相比:1)P<0.05；與本組CT基因型相比:2)P<0.05

2.5高血壓組MTHFR C677T基因多態性、Hcy水平、IMT相關性分析 MTHFR C677T基因型與Hcy水平呈正相關(r=0.783，P=0.000)，調整年齡、性別、BMI、血脂等影響因素后，MTHFR C677T基因型與Hcy水平仍呈正相關(r=0.770，P=0.001)。Hcy水平與IMT呈正相關(r=0.591，P=0.006)，其中H型高血壓組的相關性更高(r=0.793，P=0.000)，調整年齡、性別、BMI、血脂等影響因素后，Hcy與IMT仍存在正相關性。

2.6對影響IMT的因素進行Logistic分析 以MTHFR C677T基因型率作為自變量，以是否發生H型高血壓合并頸動脈內膜增厚為因變量，結果顯示TT基因型患者H型高血壓合并頸動脈內膜增厚及存在AS斑塊的風險是CC基因型和CT基因型的2.213倍(OR=2.213，95%CI：1.097～4.186，P=0.023)，調整年齡、性別、BMI、血脂等傳統因素后，TT基因型患者H型高血壓合并頸動脈內膜增厚及存在頸AS斑塊的風險是CC基因型和CT基因型的2.090倍(OR=2.090，95%CI：1.072～4.101，P=0.030)。

3 討 論

Hcy是一種含硫氨基酸的中間產物，其在體內含量微少，目前研究認為Hcy代謝關鍵酶MTHFR的活性降低、葉酸、維生素B6等輔酶缺乏是導致Hcy水平升高的主要因素〔11～13〕。MTHFR基因的突變可對Hcy的再甲基化途徑產生影響，造成Hcy水平的升高〔14〕。研究發現，TT型酶活性在37℃時較CC型下降50%～60%，46℃時下降約65%；CT型突變酶活性也有所降低，但較TT型酶活性高〔15〕。MTHFR基因677位C突變為T可使MTHFR酶活性降低，引起Hcy再甲基化受到影響，導致血Hcy水平升高〔16〕。本研究結果提示MTHFR C677T基因型的不同與H型高血壓患者血Hcy水平密切相關。

H型高血壓是合并Hcy升高的高血壓，其包含引發AS性心血管疾病的高血壓和高Hcy兩大危險因素〔17〕。另有研究報道，高血脂也與AS性心血管疾病密切相關。研究報道，高血脂患者約70%合并高尿酸血癥，而高尿酸被證實是心血管疾病死亡的獨立危險因素，因此積極控制高血脂水平，對心血管疾病患者具有重要意義。本研究結果提示血脂水平不隨Hcy水平的變化而有顯著變化。高濃度的Hcy可對血管內皮產生直接的毒性，造成血管內皮損傷，而血管內皮細胞結構和功能受損是AS形成的起始因素〔18,19〕。高Hcy水平可通過下調血管內皮細胞纖溶酶原激活劑(t-PA)mRNA表達，上調纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1 mRNA 表達，降低纖溶系統活性，造成凝血和纖溶功能紊亂，促進AS的發生和發展〔20,21〕。研究表明，高Hcy可與高血壓協同促進AS斑塊形成，誘發腦血栓、急性腦梗死等疾病〔22〕。另有統計數據指出IMT增加和缺血性腦卒中的發生風險呈顯著正相關〔23〕。大量研究表明，頸動脈IMT具有較高的預測心血管疾病發生的價值〔24,25〕。本研究與上述研究結論一致。

有研究指出MTHFR C677T參與動脈內彈力層的斷裂，促進平滑肌細胞遷移至內膜中，引發動脈粥樣硬化〔26,27〕。Hou 等〔28〕研究發現，MTHFR C677T基因突變者的心血管疾病發生率較對照組升高3倍。研究報道，與正常組相比，腦卒中患者MTHFR基因純合子和雜合子突變的發生率均顯著升高，其表明MTHFR C677T基因突變可能是腦卒中的易感因素〔29,30〕。本研究提示在H型高血壓患者中，MTHFR C677T基因多態性是導致患者頸AS發生發展的獨立危險因素，純合子突變者發生頸動脈IMT增厚或頸AS斑塊的風險顯著升高。

綜上，高Hcy水平、MTHFR C677T的多態性顯著增加IMT增厚及斑塊形成的風險，且純合子突變發生動脈IMT增厚的風險更高。但因為本研究樣本量較小，仍需進一步擴大樣本量進行深入研究。