人參、鹿茸水提物配伍前后對D-半乳糖致衰老小鼠的影響

崔長升 史秋萍 許寧 齊濱 王任晶 楊洋 張羽 趙大慶 劉莉

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117；2吉林省人參科學(xué)研究院)

人參鹿茸的配伍應(yīng)用歷史悠久，《普濟(jì)方》中含參、茸的方劑有116首〔1〕。參茸顆粒收載于國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編。具有補(bǔ)心氣，益心腎的功效，用于體虛神祛，心悸氣短，腰膝酸軟，陽痿遺精〔2〕。由于含參茸產(chǎn)品制劑安全無毒〔3，4〕，參茸產(chǎn)品開發(fā)方面?zhèn)涫苋藗冴P(guān)注。近年來，大量研究表明人參和鹿茸都具有抗氧化活性，但都主要集中于單味藥的抗氧化研究〔5，6〕，二者配伍后抗氧化活性的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要通過設(shè)計(jì)人參水提液(GA)、鹿茸水提液(PA)、人參和鹿茸水提物配伍(GPA)三組試驗(yàn)探討三者對D-半乳糖致衰老小鼠的保護(hù)作用。

1 材料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人參購于吉林撫松。鹿茸為梅花鹿鹿茸，購于吉林雙陽。ICR種小鼠，雄性，體重(22±2)g，SPF級，批準(zhǔn)號：SCXK(吉)2016-0003，購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)、還原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)測試盒購于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；D-半乳糖，上?；菔郎噭┯邢薰?；其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 離心機(jī)(TDL-80-2B型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(Infinite M200 Pro型)；石蠟切片機(jī)(RM2235型，德國萊卡測量系統(tǒng)設(shè)備有限公司)；自動包埋機(jī)(EG1150H型，德國萊卡測量系統(tǒng)設(shè)備有限公司)；烘片機(jī)(HI1220型，德國萊卡測量系統(tǒng)設(shè)備有限公司)；鋪片機(jī)(HI1210型，德國萊卡測量系統(tǒng)設(shè)備有限公司)；體視顯微鏡(SMZ25型)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品的制備 人參粉碎，過80目篩。取50 g粉末，加入8倍水煎煮2 h，濾過，濾渣加6倍量水煎煮1 h，合并濾液，蒸干即得GA。鮮鹿茸剪碎，取50 g，加入8倍水煎煮2 h，濾過，濾渣加6倍量水煎煮1 h，合并濾液，蒸干即得PA。將GA與PA按1∶1的比例混合即得GPA。

1.3.2小鼠分組及處理 將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、GA組、PA組、GPA組，每組10只。除正常對照組外，其他各組腹腔注射D-半乳糖，劑量為150 mg/(kg·d)，以體質(zhì)量計(jì)，下同；正常對照組的小鼠注射等體積生理鹽水；GA、PA、GPA組分別給予100 mg/(kg·d)的GA、PA、GPA灌胃，正常對照組及模型對照組則等體積的生理鹽水灌胃，持續(xù)處理42 d。

1.3.3小鼠實(shí)驗(yàn)樣本的采集 第42天給藥12 h后(禁食不禁水)，稱質(zhì)量。采用摘眼球取血，脫頸處死，收集血清，低溫保存，用于血清生化指標(biāo)測定。提取肝臟和腦組織，一部分肝臟及右腦勻漿，按照器官1∶9(m/V)的比例加入冷生理鹽水，勻漿器冰浴研磨制備成10%的肝組織勻漿，3 500 r/min、4℃離心10 min，取上清液，低溫保存，用于組織生化指標(biāo)測定。另一部分肝臟及左腦于4%多聚甲醛中固定，用于組織切片觀察。

1.3.4生化指標(biāo)測定 血清、肝、腦組織勻漿的SOD、GSH、CAT和MDA含量測定均按照試劑盒說明書的方法進(jìn)行。

1.3.5組織切片觀察 從4%多聚甲醛固定液中取出肝、腦組織，脫水，透明，包埋，制作石蠟切片，蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片，于顯微鏡觀察。

1.4數(shù)據(jù)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1GA、PA、GPA對D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT 、GSH和MDA含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清中SOD、CAT、GSH含量明顯降低，MDA含量升高(P<0.01)，表明小鼠衰老模型建立成功。與模型對照組比較，GA組、PA組、GPA組SOD、CAT、GSH的含量明顯升高，MDA含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 GA、PA、GPA對D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT、GSH和MDA含量的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型對照組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.2GA、PA、GPA對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟SOD、CAT 、GSH和MDA含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝組織中SOD、CAT、GSH含量明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.01)，表明小鼠衰老模型建立成功。與模型對照組比較，GA組、PA組、GPA組SOD、CAT(PA組除外)、GSH含量顯著升高(P<0.05,P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.3GA、PA、GPA對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織SOD、CAT 、GSH和MDA含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠腦組織中SOD、CAT、GSH含量明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.01)，表明小鼠衰老模型建立成功。與模型對照組比較，GA組GPA組CAT 、GSH、SOD含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01)。PA組GSH含量顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.01)。見表3。

表2 GA、PA、GPA對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟SOD、CAT、GSH和MDA含量的影響

表3 GA、PA、GPA對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織SOD、CAT、GSH和MDA含量的影響

2.4GA、PA、GPA對D-半乳糖致衰老小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響 正常對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞相互連接形成肝板，以中央動脈為中心向周圍呈輻射狀形成肝小葉，肝細(xì)胞之間空隙形成肝血竇，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核較大，核仁明顯，無炎性細(xì)胞浸潤。模型對照組肝細(xì)胞內(nèi)炎性細(xì)胞較多，胞質(zhì)疏松，細(xì)胞界限模糊，肝血竇不明顯，染色質(zhì)固縮；GA、PA組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，著色清晰，肝板排列不整齊，炎性細(xì)胞浸潤減輕，染色質(zhì)固縮現(xiàn)象緩解；GPA組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，著色清晰，肝血竇明顯，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞界限明顯，胞核胞質(zhì)未發(fā)現(xiàn)異常，形態(tài)結(jié)構(gòu)較好。見圖1。

2.5GA、PA、GPA對D-半乳糖致衰老小鼠組腦織結(jié)構(gòu)的影響 正常對照組大腦組織結(jié)構(gòu)正常，大腦皮層分子層、錐體細(xì)胞層分層較明顯；與正常對照組相比較，模型對照組細(xì)胞分層不明顯，錐體細(xì)胞數(shù)量較少，散落分布；GA、PA、GPA組大腦細(xì)胞分層明顯，錐體細(xì)胞明顯增多。見圖2。

箭頭表示炎性細(xì)胞圖1 各組肝組織切片(HE，×200)

1.大腦分子層；2.錐體細(xì)胞層；箭頭表示錐體細(xì)胞圖2 各組腦組織切片(HE，×200)

3 討 論

1985年，D-半乳糖衰老模型由徐黻本教授提出，D-半乳糖致衰老的過程與機(jī)體的自然衰老過程較為相似，因此已被廣泛應(yīng)用于抗氧劑、抗衰老藥物等的篩選〔7，8〕。D-半乳糖進(jìn)入體內(nèi)引起的氧自由基代謝失衡是誘發(fā)衰老的主要原因。過量D-半乳糖會使機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)半乳糖醇積累，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，體內(nèi)活性氧水平升高，細(xì)胞脂質(zhì)受損，以致機(jī)體多器官、多系統(tǒng)的功能減退，最終導(dǎo)致衰老的發(fā)生〔9〕。

董會萍〔10〕研究發(fā)現(xiàn)最佳D-半乳糖小鼠衰老模型的劑量范圍為120～150 mg/(kg·d)，頸部皮下注射與腹腔注射無明顯差異。故本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射D-半乳糖致衰老模型，給藥劑量為150 mg/(kg·d)。徐輝等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)衰老模型組肝細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞廣泛脂肪樣變性，胞質(zhì)明顯疏松、腫脹，并可見點(diǎn)狀及灶性壞死。正常組肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核較大，核仁明顯，染色質(zhì)稍疏松，匯管區(qū)無炎性細(xì)胞浸潤。所以肝組織結(jié)構(gòu)變化常作為肝臟損傷的考察指標(biāo)。衰老小鼠在學(xué)習(xí)記憶功能上可明顯減退，這種改變與其記憶相關(guān)腦區(qū)大腦皮層、海馬等突觸界面形態(tài)結(jié)構(gòu)的衰老性變化有關(guān)，也常用做篩選具有抗衰老的藥物〔12，13〕。

D-半乳糖衰老模型生化指標(biāo)一般主要有SOD、CAT、GSH和MDA。GSH 是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑之一，能有效緩解機(jī)體內(nèi)的氧化損傷，其含量可以衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，MDA是機(jī)體內(nèi)的自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化的一種產(chǎn)物，常用來評價衰老程度。SOD是體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，能夠有效清除超氧陰離子自由基，產(chǎn)生過氧化氫，CAT可分解過氧化氫，與SOD可協(xié)同徹底清除超氧離子，降低MDA及自由基代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，使細(xì)胞免受破壞〔14～17〕。

本研究表明，人參、鹿茸及其二者配伍后均能不同程度升高D-半乳糖致衰老模型小鼠血清、肝臟和腦組織中SOD、 CAT、GSH水平，降低MDA水平。相同給藥劑量條件下，GA抗氧化活性優(yōu)于PA抗氧化活性，GPA后抗氧化活性明顯增加，二者具有協(xié)同作用。其機(jī)制可能與其提高機(jī)體的抗氧化能力有關(guān)，本研究結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)和利用人參鹿茸資源提供參考。