類表皮生長因子域7在創傷性腦損傷后腦組織中的表達變化及意義

徐鵬翔 許瓊冠 李強 羅孟亞男 成凱 謝鎮明 付宙鋒

(海南醫學院第二附屬醫院 1神經外科，海南 570311；2放射治療科)

創傷性腦損傷(TBI)已成為全球死亡率和發病率的主要原因〔1〕。腦外傷幸存者經常遭受認知、生理和心理社會功能的暫時或永久性損害。血管生成不僅存在于身體的生長發育過程中，而且是傷口愈合、缺血、缺氧和炎癥過程中的一種生理現象，與多種疾病的發生、發展和預后密切相關〔2〕。表皮生長因子樣結構域(EGFL)7是近年來發現的內源性血管生成調節因子，在胚胎血管生成及大多數正常成年組織在生理或病理性血管生成過程中起關鍵作用〔3,4〕。EGFL7編碼蛋白含有分泌信號肽序列，該序列具有半胱氨酸(EMI)結構的N-末端以調節細胞間黏附，兩個與蛋白質鑒定相關的EGF-樣結構及富含賴氨酸和纈氨酸的高保守C-末端〔5〕。體外研究顯示，神經干細胞(NSC)可通過EGFL7參與調控血管的形成，然而EGFL7在TBI中的表達和功能尚不清楚〔6〕。本研究擬通過建立TBI大鼠模型檢測腦組織中EGFL7的表達情況及EGFL7在腦血管生成中的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 成年雄性SD大鼠，6周齡，體重291～342 g，23℃的室溫下以12 h的暗-光循環，自由獲取食物和水。隨機分為假手術組(sham，n=10)和TBI組(n=60)，TBI組分為TBI后1 h、6 h、24 h、3 d、7 d、14 d 6個亞組各10只。TBI組進行實驗性腦外傷造模，并在受傷后的上述6個時間點處死。

1.2大鼠TBI模型建立 參照文獻方法建立了彌漫性頭部損傷的大鼠模型〔7〕。每只大鼠腹腔注射4%水合氯醛(50 mg/kg體重)麻醉，同時使用加熱墊維持正常體溫。隨后將頭部固定在立體定位框架中，沿中線制作10 mm切口以暴露顱骨。在保持硬腦膜完整的同時，在冠狀縫線后3.0 mm和矢狀縫側面2.0 mm處進行右開顱(直徑4 mm)。應用1.8～2.0 atm的沖擊壓力制造TBI模型。然后縫線封閉切口，讓大鼠從麻醉中恢復。假手術組僅進行開顱手術。所有手術均在無菌環境中操作。

1.3收集腦組織標本 分別在TBI后不同時間后處死并采集大腦組織標本。在4%水合氯醛(50 mg/kg體重，腹腔注射)深麻醉下對每組6只進行開胸手術。用0.9%的生理鹽水500 ml加肝素鈉12 500 U通過左心室內灌注，打開右心房，直到流出液清澈為止，采集挫傷區周圍皮層樣本，立即置于液氮中，進行Western印跡和實時熒光PCR分析。采用0.9%生理鹽水灌注腦組織進行免疫組化分析，浸泡于4℃的4%多聚甲醛緩沖液24 h。

1.4Western印跡分析 將儲存在液氮中的大腦挫傷區周圍組織樣本解凍，溶解在放射免疫沉淀法(RIPA)緩沖液〔1%乙基苯基聚乙二醇(NP40)，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，1 mmol/L釩酸鈉(Na3VO4)，1 mmol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，0.5 mmol/L二硫蘇糖酸(DTT)，20 mmol/L氟化鈉(NaF)，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)〕中，并補充蛋白酶抑制劑。勻漿在10 000 r/min下4℃離心15 min，然后收集上清液，并測定其中蛋白質濃度。在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上加載等量(每道 40 μg)蛋白質，在70 V的恒定電壓下電泳30 min，然后在120 V下電泳90 min，最后在300 mA下轉移到聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂乳在20℃封閉膜2 h，然后加入兔抗EGFL7抗體(5%脫脂乳中稀釋1∶1 000；美國BioWorld技術公司)、兔抗CD34抗體(5%脫脂乳中稀釋1∶500；美國BioWorld技術公司)和β-actin(5%脫脂乳中稀釋1∶4 000；美國BioWorld公司)孵育過夜。在三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)中清洗3次，并在室溫下用適當的辣根過氧化物酶(HRP)結合二級抗體(在吐溫20中稀釋1∶5 000；美國Santa Cruz公司)覆蓋2 h。膜再次清洗3次，并在增強化學發光檢測系統(英國Amersham Biosciences公司)中孵育，之后暴露于射線照相膠片(日本Fujihyperfilm公司)。根據平均像素密度計算為靶蛋白/β-actin表達的比率。

1.5RNA分離與實時熒光定量PCR分析 使用Trizol試劑(中國Takara生物技術公司)從冷凍的皮層組織中提取總RNA。用分光光度法(OD260/280范圍1.8～2.0)和1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的濃度和純度。利用PrimescriptTMRT試劑盒(中國Takara生物技術公司)和寡核苷酸引物將分離出的RNA反轉錄成cDNA。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，所用序列來自大鼠EGFL7和GAPDH的NCBI數據庫。大鼠EGFL7正向和反向引物分別為5′-CCGGCCATTTGATGCCT-3′、5′-GCGAGTGCTTTGAGTAGAG-3′；大鼠GAPDH正向和反向引物分別為5′-AATGTCCGTCGTGGATCTGA-3′、5′-AGTGTAGCCCAAGATGCCTT C-3′。采用實時SYBR Green qPCR Master Mix(中國Takara生物技術公司)進行定量實時PCR分析。反應混合物中含有10 μl SYBR預混物Ex Taq、0.8 μl引物(10 μmol/L)、2 μl cDNA和7.2 μl的核酸酶游離水，最終體積為20 μl。在95℃循環30 s后進行40個PCR循環，每個循環包括變性步驟(95℃，5 s)和退火步驟(60℃，30 s)。用GAPDH mRNA的數量對每個樣品的總RNA濃度進行歸一化，EGFL7基因的表達水平由EGFL7 mRNA與GAPDH mRNA的比率來評估。

1.6免疫組化分析 采用4%多聚甲醛在4℃固定腦組織，石蠟包埋。切割4 μm厚的腦冠狀部(包括挫傷區和海馬區)進行免疫組化。將切片在磷酸鹽緩沖液(PBS)中用3%的H2O2脫蠟培養10 min，然后用5%的正常胎牛血清在PBS中阻斷2 h。切片在4℃下用兔抗EGFL7抗體(稀釋1∶200；美國BioWorld技術公司)和兔抗CD34抗體(稀釋1∶500；美國BioWorld技術公司)孵育過夜，然后在PBS中洗滌30 min，用HRP標記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(稀釋1∶500；美國Santa Cruz公司)室溫下孵育1 h。再次沖洗30 min后，用二氨基聯苯胺進行免疫標記，蘇木精復染。每個腦組織樣本中隨機選取5個區域用于細胞計數。在光學顯微鏡下測定EGFL7、CD34陽性細胞的數量，并由一名不了解該分組的研究者進行分析。采用6個隨機非重疊區的EGFL7、CD34陽性細胞平均數進行統計分析。

1.7細胞轉染 采用人EFGL7基因序列5′-GCACCTACCGAACCATCTATA-3′合成siRNA引物：5′-GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAAC GTGACACGTTCGGAGAACTTTTTTG-3′和5′-AATTCAAAAAAGTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGA AACGTGACACGTTCGGAGAACG-3′。退火后，將引物與線性穿梭質粒病毒載體(pLV3)連接，形成pLV3/siRNA/EGFL7復合物，用于轉染課題組前期建立的NSC和內皮細胞(HUVEC)共培養系統〔6〕，具體方法為采用0.4 μm孔徑的Transwell小室將NSCs和HUVECs以1∶1比例〔(1×104)∶(1×104)〕分隔培養，Transwell小孔放置NSCs，24孔平板中接種HUVECs。共培養24 h后將含8 μg/ml聚布倫的DMEM全培養基稀釋EGFL7-siRNA轉染載體加到含有NSC-HUVEC共培養系統中融合，繼續培養72 h后，收集細胞并按照1.4中方法分析EGFL7、CD34、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化(p)-AKT蛋白表達。對照組僅加入DMEM全培養基。

1.8統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、Post Hoc檢驗。

2 結 果

2.1TBI誘導EGFL7和CD34表達上調 EGFL7 mRNA、蛋白及CD34蛋白水平在腦外傷后24 h顯著升高(P<0.05,P<0.01)，第3天達峰值，并持續至少14 d。見表1。

表1 腦外傷后不同時間點挫傷周圍皮層EGFL7 mRNA的表達水平和EGFL7和CD34的蛋白表達

與sham組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.2挫傷周圍皮層和同側海馬區EGFL7和CD34陽性細胞數 與假手術組相比，TBI大鼠挫傷周圍皮層和海馬區EGFL7和CD34陽性細胞顯著增加(P<0.01)，見圖1、2，表2。

圖1 TBI大鼠挫傷周圍皮層和海馬區EGFL7陽性細胞(免疫組化，×100)

圖2 TBI大鼠挫傷周圍皮層和海馬區CD34陽性細胞(免疫組化，×100)

組別周圍皮層EGFL7CD34同側海馬區EGFL7CD34sham組26±448±618±336±5TBI 3 d亞組88±91)155±101)73±71)88±81)

與sham組比較：1)P<0.01

2.3沉默EGFL7對NSC-HUVEC共培養系統的p-AKT、AKT、PI3K表達影響 特異性siRNA干擾致EGFL7的蛋白表達明顯受到抑制后，EGFL7-siRNA表達載體轉染組NSC-HUVEC共培養系統的CD34、AKT、p-AKT、PI3K蛋白的相對表達均較對照組顯著降低(P<0.05,P<0.01)，見表3、圖3。

表3 NSC-HUVEC共培養系統經EGFL7-siRNA轉染72 h后EGFL-7、CD34、p-AKT、AKT、PI3K蛋白表達

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

圖3 NSC-HUVEC共培養系統經EGFL7-siRNA轉染72 h后EGFL-7、CD34、p-AKT、AKT、PI3K蛋白的表達

3 討 論

血管生成能為組織提供氧氣和營養，改善組織缺血，促進受損腦組織的結構重塑，從而加速神經功能的修復〔8〕。因此，促進血管生成可能是治療腦外傷后缺血性腦損傷的一種新方法。血管生成是一個復雜的過程，對神經細胞的修復和大腦損傷后的功能恢復至關重要〔9〕。EGFL7是一種新的促血管生成因子，在胚胎發育過程中對血管生成起關鍵調節作用。在正常成人組織中，EGFL7表達下調或不表達，但在富含血管的組織(包括肺、心臟和子宮)中處于高水平表達〔10〕。EGFL7在生理或病理條件下重新激活，參與血管生成〔6〕。此外，EGFL7的高表達與幾種腫瘤類型中的血管形成有關，包括結腸、胃、乳腺、腎、肝和腦腫瘤〔11～13〕。本研究表明EGFL7表達可能是促進腦損傷后血管生成的關鍵因素。盡管以前的研究表明EGFL7是由血管HUVEC或其前體細胞分泌〔12〕，但本研究免疫組織化學染色顯示，在TBI大鼠挫傷周圍皮層和海馬區中，EGFL7均有表達。EGFL7在神經細胞中的表達也被證實。這可能意味著在神經細胞中存在先前未識別的EGFL7功能，即在HUVEC上或兩者上存在旁分泌血管生成功能。總的來說，這些發現似乎是EGFL7應對腦損傷后血管生成的關鍵因素，了解TBI大鼠挫傷進展過程中EGFL7的表達是如何啟動的及控制EGFL7的位置和表達的因素將有助于理解腦外傷修復的細胞和分子機制。研究證實，在EGFL7高表達情況下，HUVEC可形成較多的管道樣結構，而將EGFL7基因沉默后，上述管道樣結構消失，說明NSCs可通過EGFL7參與調控血管的形成〔6，14〕。基于這些發現，本研究顯示EGFL-7基因沉默顯著抑制了NSC-HUVEC共培養系統中p-AKT、PI3K蛋白表達及HUVEC的血管生成能力。PI3K/AKT信號通路是執行多種生物學功能的信號調控系統，如細胞存活、增殖，代謝調控和細胞遷移等〔15,16〕。PI3K活化后在細胞膜上生成PIP3，并與信號蛋白分子AKT結合并活化AKT〔17〕。Karar等〔18〕研究顯示AKT的持續內皮激活誘導血管的發育和血管管腔結構的形成。因此，上述結果提示EGFL-7可能通過PI3K/AKT通路參與NSCs的血管生成。