骨髓間充質(zhì)干細胞移植在小鼠腦梗死中的作用機制及對大腦HMGB1水平的影響

張桂芳 楊孟麗 常玉霞 高石娟 譚偉麗 李天曉 陳雪梅

(1河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；2鄭州大學第一附屬醫(yī)院)

腦梗死又稱為缺血性腦卒中，是由于各種原因引起的局部腦組織發(fā)生缺血性供應(yīng)障礙，從而導致腦組織缺氧、缺血或發(fā)生變性壞死，繼而產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)缺損癥狀〔1〕。臨床上將腦梗死發(fā)病機制分為腦血栓形成、腔隙性腦梗死與腦栓塞3類，均與動脈粥樣硬化、高血壓、飲食不當及過度精神壓力有關(guān)，臨床表現(xiàn)為頭昏、一過性肢體麻木、無力等，嚴重者將危及生命〔2〕。目前，臨床上對于腦梗死多以溶栓、腦神經(jīng)保護治療為主，雖然能延緩病情發(fā)展，降低死亡率，但是遠期預后較差，且存活患者中50.0%～70.0%伴有后遺癥〔3,4〕。骨髓間充質(zhì)干細胞是一種特殊的細胞，具有取材簡單、免疫原性低、可自體取材等優(yōu)點，成為腦梗死治療的首選干細胞〔5〕。研究結(jié)果表明〔6〕，骨髓間充質(zhì)干細胞移植能促進腦梗死神經(jīng)功能恢復且安全，能為腦梗死治療提供思路。但骨髓間充質(zhì)干細胞治療腦梗死的具體機制尚有待闡明〔7〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1是一種高度保守的核蛋白，廣泛分布于哺乳動物中，且隨著晚期促炎作用的進一步研究而成為危重醫(yī)學研究熱點〔8〕。研究表明〔9〕，HMGB1是腦梗死早期腦部炎癥相對重要的誘發(fā)因子，腦梗死后腦部多數(shù)HMGB1均從壞死的神經(jīng)原中釋放。目前，骨髓間充質(zhì)干細胞對腦梗死組織中HMGB1低水平的影響研究較少，本文擬探討骨髓間充質(zhì)干細胞移植在小鼠腦梗死中作用機制及對大腦HMGB1水平影響。

1 資料與方法

1.1實驗動物 參與實驗的C57小鼠45只(7～8 w)，雌雄不限，體質(zhì)量20～26 g，動物合格證號：SCXK-2007-0003，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食。5只用于骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定；其余40只隨機取10只，設(shè)為空白對照組，剩余30只采用線栓法完成腦梗死動物模型建立，建模成功后分為模型對照組、溶劑組與干細胞組各10只。

1.2儀器與設(shè)備 胎牛血清(美國Gibco公司)、H-DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)、水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)、多聚甲醛(北京化工廠)、高速冷凍離心機(德國賽多利斯公司)、手術(shù)器械一套(由醫(yī)院提供)、倒置顯微鏡(日本Olympus)。

1.3細胞分離、鑒定 (1)細胞的分離、培養(yǎng)：5只C57小鼠，采用5%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，待麻醉生效后常規(guī)消毒、鋪巾，取雙側(cè)髂骨、脛骨與股骨浸泡在75%酒精中5 min，剝?nèi)ス穷^上附著的肌肉，剪開骨兩端，采用1 ml注射器抽取磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗骨髓并移至培養(yǎng)皿中，對骨髓懸液進行反復吹打，直到看不見明顯的顆粒細胞懸液〔10〕。將獲得的細胞懸液置入Ficoll淋巴細胞分離液中，3 000 r/min離心30 min，去上清，吸出白膜層，PBS清洗3次，3 500 r/min離心5 min，PBS連續(xù)清洗3次，去上清，加入含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基2 ml，吹打細胞團，讓細胞懸浮于培養(yǎng)基中。取細胞懸液10 μl在細胞計數(shù)板上計數(shù)，取(5～10)×105/ml細胞培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，去除未貼壁的細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；待細胞融合80.0%以上后進行傳代培養(yǎng)，取第3代細胞備用〔11〕。(2)細胞鑒定：分別取骨髓間充質(zhì)干細胞10×106，將其分為4分，分別加入CD34、CD90、CD73及不加抗體的稀釋液，常溫下孵育30 min，3 500 r/min離心5 min，去上清，加入PBS并不斷吹打細胞，倒置顯微鏡下計數(shù)，待細胞孵育良好后采用流式細胞儀完成骨髓間充質(zhì)干細胞鑒定，重復3次，取平均值〔12〕。

1.4動物模型建立及處理 造模小鼠均采用10.0%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量3 ml/kg，待麻醉生效后常規(guī)消毒、鋪巾。正中部位切開頸前皮膚，完成頸總動脈/頸外動脈、頸內(nèi)動脈(ICA)的分離，給予動脈夾完成頸總動脈近端與頸外動脈夾閉，利用血管夾夾閉ICA與椎動脈。在頸外動脈近端頸總動脈分叉部位做長2～3 mm的小切口，插入8-0尼龍纖維線，將纖維線送到頸內(nèi)動脈近端后松開，然后將血管夾打開，繼續(xù)前行直到遇到阻力位置，建立短暫性腦缺血小鼠模型，扎緊ICA、椎動脈〔13〕。假體手術(shù)組建模后與空白對照組進行常規(guī)喂養(yǎng)，經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1 ml，溶劑組注射200 μl 5%鼠血清的RPMI1640培養(yǎng)基，干細胞組注射骨髓間充質(zhì)干細胞5×106個(約1 ml)，干預后30 d進行評估。

1.5觀察指標 (1)骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)、鑒定：在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長及第3代細胞形態(tài)；觀察流式細胞儀測定下細胞表面標準物水平〔14〕；(2)神經(jīng)功能缺損：采用改良神經(jīng)功能缺損量表(mNSS)對各組建模前、干預后1、10、20及30 d神經(jīng)缺損進行評估。該量表主要從運動、反射及感覺3方面進行評估，總分18分，分值越低治療效果越理想〔15〕；(3)炎癥因子：各組建模前、干預后30 d尾靜脈采血2 ml，血清分離后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定白細胞介素(IL)-6、IL-10及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β水平〔16〕；(4)HMGB1水平：向上述分離的血清標本加入蛋白酶抑制劑(PMSF)，吹打混合均勻后，4℃ 3 500 r/min離心5～6 min，取其上清為組織總蛋白，采用Western印跡測定各組血清中HMGB1表達水平，以β-actin作內(nèi)參，采用美國LI-COR公司的Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)對條帶進行分析〔17〕。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1骨髓間充質(zhì)干細胞倒置顯微鏡下形態(tài)與鑒定 原代骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)不一，形狀多為梭形；傳代培養(yǎng)后第3代細胞增長迅速、排列具備一定的方向性，多呈旋渦狀生長，但細胞界限不清，見圖1。流式細胞儀測定結(jié)果表明：分離獲得的骨髓間充質(zhì)干細胞CD34占1.4%，CD73為98.6%，CD90為99.1%，說明分離獲得的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞，見圖2。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞倒置顯微鏡形態(tài)(×200)

圖2 骨髓間充質(zhì)干細胞流式細胞儀結(jié)果

2.2各組神經(jīng)功能缺損評分比較 各組建模前神經(jīng)功能缺損評分均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干細胞組干預后各時間點神經(jīng)功能缺損評分均顯著低于溶劑組、模型對照組且顯著高于空白對照組(P<0.05)；溶劑組干預后各時間點神經(jīng)功能缺損評分均顯著低于模型對照組且顯著高于空白對照組(P<0.05)；模型對照組干預后各時間點均顯著高于空白對照組(P<0.05)；見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較(分，

與空白對照組比較:1)P<0.05；與模型對照組比較:2)P<0.05；與溶劑組比較:3)P<0.05；下表同

2.3各組炎癥因子比較 各組建模前IL-6、IL-10及TGF-β水平比較均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干細胞組干預后30 d IL-6水平顯著高于溶劑組與模型對照組且顯著低于空白對照組(P<0.05)，IL-10、TGF-β水平均顯著低于溶劑組與模型對照組且顯著高于空白對照組(P<0.05)；溶劑組干預后30 d IL-6水平顯著高于模型對照組且顯著低于空白對照組(P<0.05)，IL-10、TGF-β水平均顯著低于模型對照組且顯著高于空白對照組(P<0.05)；模型對照組干預后30 d IL-6顯著低于空白對照組(P<0.05)，IL-10、TGF-β水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。見表2。

2.4各組HMGB1水平比較 干細胞組〔(1.48±0.12)ng/ml〕與空白對照組HMGB1水平〔(1.50±0.12)ng/ml〕比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干細胞組HMGB1水平顯著高于溶劑組〔(1.03±0.23)ng/ml〕與模型對照組〔(0.74±0.15)ng/ml〕(P<0.05)；溶劑組HMGB1水平顯著高于模型對照組(P<0.05)，見圖3。

表2 各組炎癥因子比較

圖3 各組HMGB1比較

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細胞是一類源于骨髓的特殊細胞，是干細胞的重要組成部分，能在特定條件下向中胚層組織細胞分化，亦可跨胚層向外胚層、內(nèi)胚層細胞分化。同時，骨髓間充質(zhì)干細胞進入人體能主動到達受損部位，用于腦梗死中可發(fā)揮神經(jīng)保護作用，能分泌神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等神經(jīng)保護因子，從而促進腦梗死神經(jīng)功能恢復〔18〕。本研究說明骨髓間充質(zhì)干細胞移植能減輕腦梗死小鼠神經(jīng)損傷，利于恢復。骨髓間充質(zhì)干細胞移植是一種新型的干預方法，用于腦梗死中能讓植入的細胞代替受損的神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞，且干細胞的自我更新、分化則能釋放大量的營養(yǎng)因子，能維持、提高機體葡萄糖轉(zhuǎn)運體作用，從而為大腦提供充足的能力與營養(yǎng)供給，有助于促進受損腦組織修復〔19,20〕。研究表明〔21〕，骨髓間充質(zhì)干細胞抑制能降解細胞外基質(zhì)，能促進神經(jīng)突生長星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)受損后發(fā)揮抗損傷作用，能支持并保護神經(jīng)元，為新生組織的修復、再生提供氛圍。

研究表明〔22〕，過度分化的膠原細胞能釋放大量的炎癥因子，導致神經(jīng)元進一步損傷。IL-6主要由成纖維細胞、T淋巴細胞、B細胞產(chǎn)生，能刺激參與免疫反應(yīng)，促進細胞增殖、分化。IL-10屬于是一種多細胞源、多功能細胞因子，能調(diào)節(jié)細胞的生長、分化，參與炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)，是公認的炎癥與免疫抑制因子〔23〕。研究表明〔24〕，IL-10在腫瘤、感染、造血系統(tǒng)中發(fā)揮了重要的作用。TGF-β是一組新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細胞生長、分化的TGF-β超家族一員，在特定的條件下促進纖維細胞壁的生長，在組織的修復、炎癥及胚胎發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。研究表明，TGF-β能調(diào)節(jié)細胞生長、分化，直接參與機體免疫調(diào)節(jié)〔25〕。研究表明〔26〕，腦梗死常伴有炎癥因子的共同參與，且不同因子能相互作用、相互影響，加劇疾病的發(fā)生、發(fā)展。而將骨髓間充質(zhì)干細胞用于腦梗死中則能促進神經(jīng)功能恢復，改善炎癥因子水平，從根本上控制疾病發(fā)展。本研究提示骨髓間充質(zhì)干細胞能改善腦梗死小鼠炎癥因子水平。

研究表明〔27〕，骨髓間充質(zhì)干細胞能通過多種方式減輕急性腦梗死小鼠梗死體積，移植后能降低炎癥應(yīng)激反應(yīng)。HMGB首次于1973年在牛胸腺中提取、鑒定，而HMGB1是最為豐富的HMG蛋白，能參與細胞骨架的轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)，能與DNA相互結(jié)合，能參與DNA的重組、修復及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在細胞的復制及分化中發(fā)揮了重要的作用〔28〕。同時，HMGB1能誘導炎性反應(yīng)，參與腫瘤細胞的分化、遷移。在腦梗死C57小鼠中，HMGB1多呈低表達，多與腦部組織炎性反應(yīng)有關(guān)〔29〕。本研究說明骨髓間充質(zhì)干細胞能抑制HMGB1凋亡，延緩病情發(fā)展。

綜上，將骨髓間充質(zhì)干細胞移植用于腦梗死小鼠中有助于減少神經(jīng)缺損，降低炎癥因子水平，能促進腦組織中HMGB1釋放，能為腦梗死治療提供思路與方法。