苦酸通調方對HepG2細胞胰島素抵抗模型中IRS-1、PI3K、Akt蛋白表達的影響

閆冠池 王秀閣 王國強 朱浩宇 米佳

(1長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2長春中醫藥大學附屬醫院 )

糖尿病是以靶器官、靶組織胰島素作用障礙和胰島β細胞衰竭為病理表現，以血糖水平升高為特征的代謝性疾病〔1〕。國際糖尿病聯盟公布最新的“IDF糖尿病地圖”中，全球約4.25億成人患有糖尿病，中國糖尿病患病人數達到1.144億，居全球首位〔2〕。胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病的始動因素，且貫穿于整個病程，因此改善IR是治療2型糖尿病及延緩并發癥的重要策略〔3〕。肝臟為胰島素作用的重要外周靶器官和維持葡萄糖穩態與平衡的調控器官。肝細胞發生IR時的病理表現為非糖物質轉化過程增強、肝糖原累積減少且消耗增加等。

苦酸通調方在臨床實踐和動物實驗中具有改善糖脂代謝作用〔4,5〕，其中主要藥物黃連、丹參、大黃等具有改善增加靶器官胰島素敏感性、減輕炎癥反應等作用，可用于改善大鼠2型糖尿病模型的糖脂代謝〔6～9〕。此外，大黃與黃連的復方制劑較單藥應用，對2型糖尿病大鼠的糖代謝情況改善更顯著〔10〕。肝細胞通過肝糖原的合成、分解與利用參與葡萄糖攝取與儲存平衡，當肝糖原合成障礙，血糖升高使IR進一步加劇〔11〕。但苦酸通調方對IR狀態下肝糖原合成影響的具體機制研究尚未充分，故本研究中借助HepG2細胞IR模型，觀察苦酸通調方對該細胞模型內糖原含量及胰島素受體底物(IRS)-1、磷脂酰肌醇3(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)蛋白的表達，探討苦酸通調方改善2型糖尿病IR的信號通路相關機制。

1 材料、儀器與方法

1.1細胞株 HepG2細胞人肝癌細胞株購于中國科學院細胞庫。

1.2藥物及試劑 苦酸通調方(長春中醫藥大學附屬醫院藥房提供)；二甲雙胍(HY-17471A，MCE公司)；DMEM低糖培養基、胎牛血清(FBS，12100061、16140071，Gibco公司)；細胞裂解液、噻唑藍(MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(P0013、C0201，武漢碧云天生物公司)；重組人胰島素(S31559，上海源葉生物科技有限公司)；肝/肌糖原測定試劑盒(A043，南京建成生物工程研究所)；兔抗人單克隆抗體PI3K，單克隆抗體p-PI3K(Thy458)，多克隆抗體Akt，單克隆抗體p-Akt(Ser473)，單克隆抗體p-IRS-1(Ser612)(美國Cell Signaling公司，批號分別為4249，9272，4691，5831，50081，3203)；小鼠單克隆抗體IRS-1(美國Santa Cruz公司，sc-8038)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔多克隆抗體IgG(BA1054)，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠單克隆抗體IgG(BA1050，武漢博士德生物工程有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(A0216，碧云天生物技術研究所)。

1.3儀器 濕化型CO2恒溫培養箱(3111，Thermo)；YZ-875超凈工作臺(江蘇蘇州凈化設備廠)；低溫高速離心機(5804R，德國Eppendorf)；DK-S2微型振蕩器(浙江金華實驗儀器廠)；鼓風干燥箱(上海博迅醫療生物儀器公司)；M200 PRO酶標儀(瑞士Tecan公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；濕轉系統(美國Bio-Rad公司)；超低溫冰箱(900，美國Thermo Fisher)。

1.4細胞培養 HepG2細胞培養在37℃，5%CO2濕化條件中，給予10% FBS、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml的低糖DMEM培養基培養，待細胞融合度約80%時進行消化傳代。無血清基礎培養基培養細胞24 h，使各分組細胞同步化后再進行下一步實驗。

1.5MTT比色法檢測細胞活性 將MTT溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)為5 mg/ml過濾除菌后備用，選擇細胞融合度約80%的HepG2細胞，胰酶消化后，以8 000個細胞/孔的密度接種于96孔板。細胞貼壁生長24 h，吸棄原培養基，加入不同的干預液100 μl，培養24 h，每孔加入MTT溶液10 μl，置細胞于培養箱內避光孵育4 h。震蕩混勻，490 nm處測定吸光度。以空白對照組細胞的存活率為100%計算不同組別細胞存活率。模型組與空白對照組不做處理，苦酸通調方50、100、200 μg/ml為低、中、高劑量組。陽性對照組為二甲雙胍200 μg/ml。

1.6高糖聯合棕櫚酸孵育建立HepG2 IR模型 稱取19.23 mg棕櫚酸標準品溶于0.5 ml無水乙醇中，將溶解后的棕櫚酸加入24.5 ml高糖DMEM培養〔其中含有0.24 ml胎牛血清，0.5 g 牛血清白蛋白(BSA)〕，55℃水浴15 min，冷卻后過濾除菌即3 mmol/L棕櫚酸溶液，造模時稀釋至0.25 mmol/L，孵育細胞24 h，建立HepG2 IR模型。

1.7分組及處理 空白對照組加入正常培養液，模型組及低、中、高劑量組均加入造模液，孵育24 h，建立IR模型。吸棄培養液，空白對照組、模型組加入DMEM基礎培養液，低、中、高劑量組加入藥物溶液(50、100、200 μg/ml)，37℃、5%CO2培養箱內孵育24 h。

1.8細胞葡萄糖消耗量的檢測 收集細胞培養上清液，2 000 r/min離心10 min，吸取上清。苯酚硫酸法分別檢測上清液及無細胞培養液中葡萄糖的含量，兩者對比計算細胞葡萄糖的消耗量。此外，考慮苦酸通調方水溶液呈微黃色液體，藥液的顏色可能干擾定量檢測，因此另設藥液空白對照組，以消除藥液顏色在本環節中造成的誤差。

1.9肝糖原含量檢測 收集細胞，1 000 r/min，離心5 min，留細胞沉淀；用PBS清洗3次，1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，留細胞沉淀。加入0.2 ml的PBS充分混勻，低溫條件下超聲(功率：200 W，超聲3 s，間隔2 s，重復4次)，制備勻漿液測定蛋白濃度。加入堿液，置于沸水中煮15 min，室溫冷卻，按照試劑盒隨帶的說明書配制顯色液(室溫、避光)，加入顯色液，置于沸水中煮5 min。于波長620 nm測定各管吸光度，計算出糖原含量。

1.10Western印跡檢測IRS-1，p-IRS-1,PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt蛋白水平 吸棄各處理組上清，預冷PBS沖洗2次，每孔加入預冷放射免疫沉淀(RIPA)細胞裂解液，冰上裂解，刮取細胞，4℃下10 000 r/min離心10 min。BCA法測定細胞蛋白濃度。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠(10%)和濃縮膠(5%)。上樣總蛋白40 μg，加入電泳緩沖液，電泳電壓及時間(濃縮膠為80 V，30 min；分離膠為100 V，1 h)。再將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(110 V，90 min)。5%BSA封閉1 h，加入相應一抗(1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜。Tris-鹽酸緩沖鹽溶液(TBST)洗膜3次，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠第二抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h。洗膜5次后，電化學發光(ECL)顯色，拍照。

1.11統計學處理 采用SPSS22.0軟件，正態分布的數據采用ANOVA(多組檢驗)和StudentT檢驗；非正態分布的數據采用Kruskal-WillisH檢驗及Mann-WhitneyU檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞存活率 與空白對照組比較，模型組、苦酸通調方(100,200 μg/ml)及陽性對照組細胞存活率有所下降，但不明顯(P>0.05)。見表1。

2.2各組HepG2細胞葡萄糖消耗量 與空白對照組相比，模型組葡萄糖消耗量下降明顯(P<0.05)；與模型組相比，苦酸通調方增加細胞葡萄糖消耗量的效果呈劑量依賴性，且中、高劑量組和陽性對照組顯著增加HepG2 IR細胞葡萄糖消耗量(P<0.05)。見表1。

2.3各組HepG2細胞內肝糖原含量 與空白對照組相比，模型組糖原含量下降明顯(P<0.05)；與模型組相比，苦酸通調方增加細胞肝糖原含量的效果呈劑量依賴性，高劑量組和陽性對照組顯著增多(P<0.05)。見表1。

表1 各組HepG2細胞存活率、葡萄糖消耗量、肝糖原含量

與空白對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；表2同

2.4各組HepG2細胞IRS-1，p-IRS-1,PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt蛋白表達 與空白對照組比較，模型組IRS-1，PI3K，Akt磷酸化水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組IRS-1，PI3K，Akt磷酸化水平表達增加，且各指標變化呈現劑量依賴性，高劑量組改變最明顯(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 各組HepG2細胞IRS-1，p-IRS-1,PI3K,p-PI3K,Akt,p-Akt蛋白表達

圖1 各組HepG2細胞IRS-1，p-IRS-1,PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt蛋白表達

3 討 論

2型糖尿病屬于中醫“消渴”“脾癉”的范疇，苦酸通調法是“苦酸制甜”、“辛開苦降”、“活血通絡”、“解毒通絡”學說的高度概括，苦酸通調方由丹參、黃連、黃芪、知母、天花粉、制紅曲、肉桂、烏梅、生地、酒大黃組成。諸藥酸苦同用，辛苦并施，寒溫相佐，達到了苦酸制甜，辛開苦降，通達絡脈之功。

肝臟在胰島素作用下，攝取葡萄糖進行糖酵解、合成與分解肝糖原、糖異生等過程，維持機體糖代謝的平衡。因此，改善肝臟IR狀態是治療T2DM的重要手段之一。而提高胰島素受體活性，使胰島素與受體結合及信號傳遞順暢進行，加速葡萄糖轉運、儲存和代謝過程是改善IR的重要方法。肝細胞內胰島素信號主要通過IRS/PI3K/Akt，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，核因子(NF)-κB，c-Jun氨基末端活化蛋白激酶(JNK)、糖原合成激酶(GSK)等通路進行傳導，其中IRS-1/PI3K/Akt信號途徑是肝臟調節糖代謝的主要通路，在信號傳遞中，胰島素首先與胰島素受體上α亞基，促進其β亞基酪氨酸部位發生磷酸化作用，進而與IRS-1相結合，磷酸化后的IRS-1與PI3K p85亞基相互作用，通過第二信使三磷酸脂酰肌醇(PIP3)與三磷酸脂醇依賴性蛋白激酶(PDK)-1及蛋白激酶C結合，進而激活Akt，使得PDK-1促進Akt(Thy 308)磷酸化，加速葡萄糖轉運蛋白(GLUT)4轉運,增強葡萄糖攝取。同時使GSK3激活，增加肝糖原合成〔11〕。

本研究表明苦酸通調方可增強IRS-1/PI3K/Akt信號轉導過程，為改善IR治療糖尿病的作用機制之一。