miR-204-5p靶向JARID2調控葡萄膜黑色素瘤細胞增殖侵襲遷移的機制

馬宇 周利曉 劉意 武衛

(1鄭州大學第五附屬醫院眼科，河南 鄭州 450052；2鄭州鐵路職業技術學院；3鄭州大學第二附屬醫院 眼科)

葡萄膜黑色素瘤(UM)是主要發生于成人眼部的一種原發性惡性腫瘤，極易發生轉移，死亡率極高〔1〕。調查顯示，UM的致死率高達50 %，主要死于肝轉移，預后極差，近13%的患者預后存活期超過1年〔2，3〕。UM易于通過血液進行轉移，主要轉移至肝臟、肺和骨〔4〕。目前國內外針對UM的靶向治療的研究具很大潛力。miRNA是一種小的非編碼RNA，長度為19～24個核苷酸，其通過結合靶基因的3'非編碼區域，以完全或不完全互補的方式降解靶基因或抑制靶基因翻譯，以至靶基因沉默〔5〕。miR-204-5p在腫瘤中普遍作為抑癌基因發揮作用，但其在UM中的作用機制尚未十分清楚。含有JmjC域(具有去甲基化活性)的SMCX蛋白(JARID2)為Jumonji蛋白家族中的一員，其作為癌基因參與腫瘤的生理病理過程〔6，7〕。JARID2表達異?？纱龠M腫瘤細胞的上皮細胞向間質細胞轉化(EMT)，進而發揮腫瘤的惡性促進作用〔8，9〕。但JARID2在UM中的調控作用機制尚未完全清楚。本研究擬以UM細胞MUM-2B為研究對象，檢測miR-204-5p、JARID2在 MUM-2B細胞中的表達，觀察過表達miR-204-5p、敲減JARID2、過表達JARID2對MUM-2B細胞增殖、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 正常葡萄膜上皮細胞ARPE-19、UM細胞 MUM-2B 均購自美國菌種保藏中心(ATCC)；DMEM培養基、胎牛血清、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)試劑盒、電化學發光(ECL)液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養正常葡萄膜上皮細胞ARPE-19、UM細胞 MUM-2B，置于37℃，5% CO2的培養箱中常規培養。

1.2.2細胞轉染 把未作任何處理的正常培養的MUM-2B細胞標記為NC組。將miR-204-5p模擬物(mimics)、miR-對照(con)、敲減JARID2基因(si-JARID2)、敲減陰性對照(si-con)、miR-204-5p+pcDNA、miR-204-5p+pcDNA-JARID2按照脂質體LipofectamineTM2000說明書操作步驟要求轉染至U-2OS細胞，分別標記為miR-204-5p組、miR-con組、si-JARID2組、si-con組，miR-204-5p+pcDNA組、miR-204-5p+pcDNA-JARID2組轉染48 h后，用qRT-PCR檢測轉染效率。轉染成功后，用于后續試驗。

1.2.3qRT-PCR實驗 取適量對數生長期1.2.2各組細胞，按照RNA抽提試劑盒說明書要求操作提取RNA，進行定量，然后按逆轉錄試劑盒按照說明書操作合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作進行miR-204-5p、JARID2檢測。用2-△△Ct計算miR-204-5p、JARID2的表達。

1.2.4MTT實驗 取適量1.2.2各組細胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養3.5 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩，使結晶溶解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。細胞的增殖力與吸光值呈正比。

1.2.5Western印跡實驗 取1.2.2各組細胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發光液，曝光。

1.2.6Transwell實驗 將1.2.2各組細胞以106個/孔接種于細胞6孔板，培養至融合度75%時，更換無血清培養基培養過夜。調整細胞密度至105個/ml，取100 μl加入上室內，600 μl含血清的培養基加入下室，培養過夜。取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細胞數，隨機選5個視野計數，取平均值。將Transwell小室上表面鋪適量厚度的基質膠，然后按照上述操作方法操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細胞。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測實驗 取適量對數生長期1.2.2各組細胞，遵照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊要求操作。以海參熒光素酶為報告基因的載體質粒(psiCHECK2)以螢火蟲熒光素酶活性為內參，psiCHECK2-JARID2-3′UTR WT和psiCHECK2-JARID2-3′UTR MUT的表達為對照，轉染24 h后，檢測熒光強度。海參熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值即反映miR-204-5p與JARID2的結合力。

1.2.8統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1miR-204-5p、JARID2在ARPE-19細胞和MUM-2B細胞中的表達 與ARPE-19細胞相比，MUM-2B細胞中miR-204-5p的表達顯著降低，JARID2 mRNA及蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖1、表1。

2.2過表達miR-204-5p抑制UM細胞增殖 與miR-con組相比，miR-204-5p組MUM-2B細胞在48、72 h時細胞活性均顯著降低(P<0.05)。見表2。

圖1 JARID2在ARPE-19和MUM-2B細胞中的表達

細胞miR-204-5pJARID2 mRNAJARID2蛋白ARPE-191.36±0.140.79±0.110.23±0.02MUM-2B0.16±0.032.58±0.161.56±0.08t/P值14.517/0.00015.968/0.00027.936/0.000

表2 過表達miR-204-5p抑制UM細胞增殖

與miR-con組比較：1)P<0.05；表3同

2.3過表達miR-204-5p抑制UM細胞遷移和侵襲 與miR-con組相比，miR-204-5p組MUM-2B細胞遷移量和侵襲量均顯著降低(P<0.05)。見表3。

2.4miRNA-204-5p靶向JARID2 運用miRcode數據庫預測到miRNA-204-5p與JARID2 3′UTR存在結合位點(圖2A)；雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-con組相比，miR-204-5p組WT-JARID2細胞中熒光活性顯著降低，MUT-JARID2細胞中熒光活性不受影響。見表4；與miR-con組(1.42±0.12)相比，miR-204-5p組細胞中JARID2表達(0.51±0.07)顯著降低(P<0.05)，與anti-miR-con(1.51±0.11)組相比，anti-miR-204-5p組細胞中JARID2表達顯著升高(1.64±0.14，P<0.05)。見圖2B。

表3 過表達miRNA-204-5p抑制UM細胞遷移和侵襲

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-con組、miR-204-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-204-5p組圖2 miRNA-204-5p靶向JARID2

2.5敲減JARID2抑制UM細胞增殖、遷移和侵襲 與si-con組相比，si-JARID2組MUM-2B細胞JARID2蛋白表達量顯著降低(圖3)，在48、72 h時細胞活性均顯著降低，細胞遷移數和侵襲數均顯著降低(P<0.05)。見表5。

圖3 UM細胞中JDRID2的表達

表5 敲減JARID2抑制UM細胞增殖、遷移和侵襲

與si-con組比較：1)P<0.05

2.6過表達miR-204-5p和過表達JARID2影響UM細胞增殖、遷移和侵襲 與miR-con組相比，miR-204-5p組MUM-2B細胞在48、72 h時細胞活性均顯著降低，細胞遷移數和侵襲數均顯著降低；與miR-204-5p+pcDNA組相比，在48、72 h時細胞活性均顯著升高，細胞遷移數和侵襲數均顯著升高(P<0.05)。見表6。

表6 過表達miR-204-5p和過表達JARID2影響UM細胞增殖、遷移和侵襲

與miR-con組比較：1)P<0.05；與miR-204-5p+pcDNA組比較：2)P<0.05

3 討 論

UM是最常見的原發性眼內惡性腫瘤，包括虹膜、睫狀體和脈絡膜的黑色素瘤，其臨床和分子特征及其危險因素、遺傳學、發病機制、轉移行為和治療方面與皮膚黑色素瘤明顯不同〔10～12〕。目前，絕大多數UM采用全球保護放療(主要是近距離放射治療)，局部控制率>95%，摘除保留用于較大的黑素瘤，甚至可用各種晚期形式的外部放射來治療〔13，14〕。盡管對原發腫瘤進行了成功和持久的治療，但長期存活率仍然很低〔15〕。因此，研發有效的治療方案及藥物具有重要意義。

越來越多的miRNA參與腫瘤的發生，包括黑素瘤腫瘤〔16，17〕。miR-204-5p在許多人類惡性腫瘤中被下調并起到腫瘤抑制劑的作用〔18，19〕。Luan等〔20〕在黑色素瘤的研究中發現，miR-204-5p的表達異常下調，尤其是在轉移性黑素瘤中，且過表達miR-204-5p可抑制黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲，促進黑素瘤細胞凋亡，此外，基質金屬蛋白酶-9和B細胞淋巴瘤-2是miR-204-5p的功能靶標，通過它們miR-204-5p在惡性黑素瘤中發揮生物學作用，又用異種移植模型驗證miR-204-5p對惡性黑素瘤的作用，且miR-204-5p在惡性黑素瘤細胞中可增加5-氟尿嘧啶和順鉑(DDP)的化學敏感性，闡明了miR-204-5p在黑素瘤發展中的新功能和機制，為黑素瘤的治療提供了治療靶點。本研究檢測了UM細胞 MUM-2B 中miR-204-5p的表達發現，miR-204-5p表達異常降低，且過表達miR-204-5p可抑制 MUM-2B細胞的增殖、遷移和侵襲，這與Luan等〔20〕的研究結果相抑制；深入研究，用雙熒光素沒報告基因檢測實驗驗證，miR-204-5p靶向負調控JARID2。

組蛋白賴氨酸殘基的去甲基化酶(KDMs)通過調節底物的甲基化在腫瘤細胞的生物學中具有重要作用〔21，22〕。JmjC為 KDMs的一個穩定結構域，其在Jumonji蛋白家族成員JARID2中首次發現〔23〕。大量研究證實，JARID2在癌癥的發生發展中具有關鍵作用〔24～26〕。張嵐等〔27〕在舌鱗癌的研究中發現，JARID2在舌鱗癌組織和細胞中的表達均明顯升高。Radberger等〔28〕運用免疫組織化學染色法對UM患者組織研究發現，JARID1B的表達異常升高，且高JARID1B表達與較低的存活率相關。劉博等〔29〕在UM細胞的研究中發現，JARID2表達異常升高，敲減JARID2可抑制UM細胞的增殖、遷移、侵襲，提示JARID2在UM中具有重要作用。本研究檢測了UM細胞 MUM-2B中JARID2的表達發現，JARID2表達異常升高，且敲減JARID2可抑制 MUM-2B細胞的增殖、遷移和侵襲，這與劉博等〔29〕的研究結果相一致；深入研究發現，過表達JARID2可逆轉過表達miR-204-5p對UM細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-204-5p可抑制UM細胞增殖、遷移、侵襲，其機制可能與靶向JARID2有關，為UM的預防和治療提供新靶點。