骨肉瘤特異生物診斷探針制備

王華 梁驥 王法佳 周磊 馬艷 張宇飛 傅桂蓮

(1北華大學附屬醫院，吉林 吉林 132000；2廣西桂林醫學院；北華大學 3研究生院；4檢驗學院)

細胞表面具有豐富與復雜的細胞表位，表位源于細胞內染色體基因的表達。腫瘤細胞往往是某些基因發生了結構改變(丟失、插入、變異……)，這些改變會賦予腫瘤膜蛋白質或其他物質的改變從而使細胞表位更復雜，這也導致了腫瘤細胞與正常細胞表位的差異。因此依據這種差異，人們試想過很多的辦法，例如利用抗原抗體的方式進行診斷或者治療。由于抗體制備與生產的某些嚴苛的限定因素，始終沒有更好地實現這一想法。而小寡核苷酸DNA或者RNA具有更多的特點：可以自發卷曲成三維空間結構，可以進行體外化學修飾(連接生物素、氨基、羧基、熒光物質……)，而不改變與配體的結合能力，小寡核苷酸的制備、儲存、運輸及應用比抗體特別是單克隆抗體顯示更多的優勢〔1～4〕。蛋白質-核酸可以互相作為配基的理論基礎已被引入細胞膜表面配基的研究。指數富集配體的系統進化(SELEX)技術〔5～7〕的出現為腫瘤標志物的篩選及特異診斷探針研制帶來了新的契機。SELEX技術的基本原理是利用分子生物學技術人工合成單鏈隨機寡核苷酸文庫(SSDNAs)，DNAs或者RNAs，由于單鏈寡核苷酸片段能夠形成三維空間結構〔8～10〕，理論上可以同各種靶分子結合。一個高通量(1 015～1 018)的寡核苷酸庫包容了所有可能的立體結構，因此有可能從中篩到任何種類的靶分子高親和力配基。利用這一原理，將SSDNAs與靶細胞相互作用〔11～14〕，保留與靶標結合的寡核苷酸配基，并以此為模板利用聚合酶鏈反應(PCR)體外擴增篩選獲得的配基。經過幾輪或數十輪反復結合、擴增、篩選過程，最終使高親和力的寡核苷酸配基即Aptamer得到富集。目前國內外尚無對骨肉瘤生物探針的研制文獻報告。本研究以人骨肉瘤細胞(U-2 OS)為靶細胞，體外合成隨機序列的DNAs作為被選文庫，應用細胞-SELEX技術去篩選與U-2 OS高度特異性結合的細胞適配體單鏈DNA(ssDNAs)，為骨肉瘤特異診斷建立適配體庫。

1 材料與方法

1.1實驗材料 建構76 nt的ssDNA文庫：5′-ATC CAG AGT GAC GCA GCA 40(N) TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3′及5′-異硫氰酸熒光素(FITC)-ATC CAG AGT GAC GCA GCA 40(N) TGG ACA CGG TGG CTT AGT-BIO-3′，兩端為固定序列引物，中間40個堿基為隨機序列，以上均由上海生工生物工程股份有限公司合成。人骨肉瘤U2-OS細胞(陽性細胞株)，購于武漢博士德生物工程有限公司。SGC7901胃癌細胞由上海徐匯區中心醫院饋贈。

1.2主要試劑 酵母tRNA(Fluka Analytical，cat.no 83853，USA)。胎牛血清(FBS，Invitrogen，USA)。鏈霉親和素瓊脂糖(GE Healthcare Life Scicence USA)。RPMI1640培養基、 McCoys′5A 培養基、青霉素、硫酸鏈霉素(武漢博士德生物工程公司)。胰蛋白酶(北京鼎國生物技術公司，中國)。 UNIQ-10柱寡聚核苷酸純化試劑盒(上海生工生物工程公司，中國)。 2×Taq PCR Master Mix(KT201-01)、載體pGEM-T、DH5α感受態細胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生化科技公司，中國)。

1.3主要儀器 凝膠成像分析系統(USA)。 熒光分光光度計(美國安捷倫)。WD-9403C型紫外分析儀(北京市六一儀器廠，中國)。756PG型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器公司，中國)。SIGMA低溫高速離心機(美國SIGMA公司)。TGL-18G 臺式高速冷凍離心機(太倉市醫療器械廠，中國)。TDZ5-WS低速多管架自動平衡離心機(長沙湘儀離心機儀器公司中國)。CO2培養箱(美國)，IX50-S8F2倒置式生物顯微鏡(OLYMPUS日本)，JY600C電泳儀(北京君意東方電泳設備公司，中國)。Eppendorf Hamburg22331型 PCR儀(德國)。JY-96G PCR儀(北京君意東方電泳設備公司，中國)。LNG-L98 真空濃縮干膠系統(太倉市科教器材廠，中國)。親和層析空柱管(長春寶泰克公司，中國)。

1.4細胞培養PCR擴增及篩選 ①應用McCoys′5A培養液對人骨肉瘤U-2 OS細胞培養傳代。試驗前24 h在10 mm×10 mm培養皿中培養細胞達5×106。②DNA寡核苷酸文庫用結合緩沖液制備成工作液500 μl放入EP管中，超級旋轉恒溫水浴中加熱95℃ 5 min后置于冰上備用。③24 h前準備的目標細胞洗滌后將冰上預冷的DNA寡核苷酸文庫加入細胞培養盤中搖勻(第一輪終濃度10 nmol/L，第二輪開始增加至100 nmol/L)、37℃振蕩40 min、洗滌后用細胞鏟收獲細胞、95℃加熱、離心，收集上清，-20℃保存或者進入下一步試驗。④PCR擴增上清液中的ssDNA，制備高純度雙鏈DNA(dsDNA)。在這一過程中，首先對PCR擴增條件進行優化，選擇最佳循環次數與模板濃度。對于大量制備的dsDNA再應用酚-氯仿進行純化。⑤應用鏈霉親和素瓊脂糖堿變性親和層析將dsDNA分離成單鏈，收獲正鏈DNAs作為下輪篩選的文庫。⑥熒光監測特異寡核苷酸篩選過程。在第6、9、11、12和13輪篩選時進行熒光監測富集篩選的寡核苷酸。監測前24 h，3×106U-2 OS細胞(60 mm×15 mm培養皿)用10% FBS的McCoy′5A培養液培養。應用漂洗緩沖液漂洗細胞后，加入預冷的溶解在600 μl結合緩沖液中的ssDNA (1 000 nmol/L終濃度)，37℃，50 r/min 振搖40 min 。漂洗細胞后，應用300 μl結合緩沖液浸潤細胞、用細胞鏟收獲細胞并將其轉移到1.5 ml離心管內。加熱離心管95℃ 10 min，4℃ 12 000 r/min離心5 min，收獲上清液。其中部分上清液用于制備下一輪篩選的ssDNA文庫，部分上清液應用FITC-標記的上游引物和生物素(Biotin)-標記的下游引物進行PCR擴增。擴增產物經過鏈霉親和素瓊脂糖堿變性親和層析分離獲得FITC-正鏈DNA并進行熒光測定。當對照與陽性樣品熒光信號顯示明顯差異，而陽性樣品熒光信號之間無明顯漂移時終止篩選過程。⑦對最后一輪篩選的寡核苷酸文庫進行克隆測序。pGM-T作為克隆載體，依據試劑盒克隆程序將最后篩選的寡核苷酸文庫進行克隆，選擇陽性克隆質粒再進行插入序列擴增，選擇76 bp插入序列的克隆質粒進行測序并保存，同時依據克隆序列的一級結構進行同源序列分組。

2 結 果

2.1PCR優化 6、8或10個循環及10%、15%或者20%模板濃度為獲得無非特異擴增產物條帶比較理想的參數。酚-氯仿法純化dsDNA顯示了較高純度。15%模板濃度，10個循環結果最佳，見圖1及圖2。11～13輪熒光曲線接近重疊提示篩選富集的寡核苷酸趨于穩定，因此結束篩選。見圖3。

1：100 bp標準；2～5：6，8，10和12個循環；6：空白圖1 應用15%模板濃度進行PCR最佳循環次數的篩選

1：100 bp標準；2：純化后的dsDNA瓊脂糖凝膠電泳圖2 應用酚-氯仿純化dsDNA的結果

黑色光譜曲線：胃癌細胞的陰性對照；紅色：第3輪篩選；藍色：第6輪篩選；綠色：第9輪篩選；粉色：第11輪篩選；紫色：第13輪篩選圖3 熒光光譜用于檢測寡核苷酸ssDNA與骨肉瘤細胞結合的篩選過程

2.2克隆與測序 對最后一輪篩選的寡核苷酸文庫進行克隆。對克隆質粒再進行擴增，保留正確插入序列的質粒進行測序，質粒1～8含有76 bp寡核苷酸序列可以用于測序，見圖4。

1：50bp DNA標準；2～13:克隆質粒PCR擴增結果；14：空白對照圖4 質粒插入序列檢測

2.3一級結構分析并建立同源保守序列庫 例如包括含有GGTGGGGG，GGCGTTATTTG，TT(T/G)TTGG同源序列的適配體SEQ ID NO 9，11，13，67和68；包括含有AAC (A/G)CCCC，CTT(G/C)TT，CCCTGC同源序列的適配體SEQ ID NO14，21，33和37等。

3 討 論

骨肉瘤是臨床常見的青少年及老年人群的惡性腫瘤，男性發病率高；某些病例存在家族傾向?，F在發現至少有一個基因與其相關，而且這個基因也與家族性視網膜母細胞瘤相關，但是導致疾病的發生原因至今不清楚。由于肺部的轉移導致該病高死亡率。臨床確診主要綜合病理學、血清學及影像學檢查結果，因此建立一種準確、簡便、無創傷的診斷方法具有重要的臨床意義。SELEX技術主要應用高豐度空間結構的DNA或者RNA作為備選文庫，與靶物質通過反復結合、解離和PCR擴增富集，最終獲得與靶物質高度親和的寡核苷酸(DNA或者RNA)。靶物質可以是金屬離子、有機染料、氨基酸、抗體、肽、蛋白質、核酸，甚至整個細胞、病毒及細菌等。細胞是一種多表位的靶物質，蛋白質是細胞膜表面復雜表位的主要成分。分化與未分化、癌細胞與正常細胞膜的表位差異為應用整個細胞作為靶標進行特異寡核苷酸的篩選提供了結構基礎。

特異探針篩選過程中，ssDNA文庫與靶細胞的濃度比對于SELEX 篩選至關重要。在前幾輪篩選過程中，二者的投入量多確保U-2 OS細胞有效捕捉核苷酸適配體。后幾輪的篩選，由于特異適配體已經富集，因此減少了細胞的數量，由5×106減少到3×105。第6輪開始減少結合的反應時間，由40 min減少到25 min進一步減少非特異結合。

在SELEX技術中，PCR是重要的實驗步驟。因為每一輪從細胞-ssDNA復合物中分離開來的ssDNA都要制備成dsDNAs。為了獲得沒有非特異條帶的PCR產物-dsDNAs，每一輪的PCR都進行了循環次數及模板濃度的摸索。本文應用經典氯仿-酚法對擴增制備的dsDNAs進一步純化去除引物，taq酶等，有效獲得了大量純化的dsDNAs。

在制備大量dsDNAs時，將Biotin標記的反向引物引入PCR擴增，因為生物素與鏈霉親和素具有極強的親和力，因此當dsDNAs流經鏈霉親和素瓊脂糖層析介質時，Biotin標記的負鏈寡核苷酸DNA被牢固吸附，而正鏈DNAs被洗脫和收獲作為下輪篩選的文庫。這是一種優越于其他方式制備次級文庫的方法。應用熒光分光光度計監測篩選進程是因為其對比流式細胞儀的使用更簡便易行。

將第13輪篩選的寡核苷酸適配體經過PCR擴增、純化后，應用常規分子克隆技術將適配體連接到pGM-T質粒上，轉化到DH5a中。再經歷陽性轉化菌落的培養、提取質粒、PCR擴增，選擇理想的克隆質粒進行測序、同源序列編組并保存。

核酸適配體與靶物質結合所呈現的高識別性和結合性及所具有的易合成、儲存、化學修飾及可以反復變性與復性等優點遠遠超過抗體制備與應用范疇。因此，核酸適配體已經在疾病的診斷、治療與藥物的開發等領域頗受關注。本研究以人骨肉瘤U-2 OS細胞為靶細胞，應用細胞-SELEX技術成功獲得了用于骨肉瘤診斷的特異性核酸適配體庫，這也為骨肉瘤未來的導向治療搭建了可行性平臺。