miR-374促進急性心肌梗死誘導心肌纖維化的機制

王曉燕 朱磊 穆東 駱海霞 許香梅

(石家莊市第一醫院心內科，河北 石家莊 050011)

急性心肌梗死(AMI)是冠狀動脈不穩定的粥樣硬化斑塊發生破裂、出血，繼發血栓形成，引起冠狀動脈持續完全閉塞，使相應的心肌出現嚴重而持久的缺血，導致心肌壞死〔1〕。AMI后所產生的心室重構(VR)是心肌梗死向心力衰竭發展的關鍵過程，直接影響患者的轉歸。在VR的病理過程中，心肌梗死后心肌細胞的壞死和心肌間質細胞的增生導致心室的大小、形態、結構和功能狀態發生較明顯的變化，而隨著心肌成纖維細胞(CFs)的異常大量增殖，膠原沉積的持續進行和降解的減少，從而引起心肌纖維化(MF)的發生〔2〕。進一步引起心室順應性降低，心室舒張功能減退，誘發心力衰竭。當前研究證實，心肌梗死后所引發的一系列炎癥反應及炎癥因子在梗死區和非梗死區的MF中發揮了重要的作用，Ono等〔3〕發現腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-6在心肌梗死后非梗死區的表達升高，并且其表達水平與心功能惡化程度和膠原沉積程度呈正相關。因此，抑制炎癥因子的激活對于MF的防治，改善心臟功能具有重要意義〔4〕。研究顯示，微小RNA(miR)在MF等心臟疾病的發生及發展中發揮了關鍵作用。研究顯示，miR-22可促進MF的進程，miR-26a可通過下調結締組織生長因子和Ⅰ型膠原(COL1)的表達從而抑制MF〔5〕。所以miR具有成為MF防治生物標志物的潛力。本研究旨在分析miR-374對心肌梗死誘導的MF所產生的影響，探討miR-374與抗炎因子IL-10的調控關系在MF中的作用機制。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2017年10月至2018年5月在石家莊市第一醫院就診的AMI患者82例，其中男47例，女35例。選取同期50名健康體檢者為健康對照組。采集研究對象肘靜脈血5～6 ml；待血清析出后以1 200 r/min離心10 min，取上層血清保存至-80℃冰箱待檢。

1.2構建AMI小鼠模型 雄性C57/BL6小鼠隨機分為假手術組(6只)、AMI組(12只)、AMI+miR-374組(12只)。AMI組用2%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉。胸骨左緣第2～4肋開胸，識別前降支走行范圍，7/0滑線結扎左前降支，當結扎區域顏色轉為蒼白，心電圖示波為心肌梗死表現時確認模型構建成功。假手術組開胸但不結扎左冠狀動脈。其余步驟同AMI組。AMI+miR-374組采用miR-374 mimics慢病毒進行心肌局部注射。

1.3心臟功能檢測 術后2 w，10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，然后心臟彩超檢查并記錄左室射血分數(LVEF)，左室長軸縮短分數(FS)，左室舒張末期內徑(LVDd)和左室收縮末期內徑(LVDs)。

1.4半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3和Caspase8活性檢測 按照Caspase3和Caspase8活性檢測試劑盒說明書檢測。

1.5實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測 采用Trizol 法提取總RNA，實驗按照Trizol試劑盒說明書操作，將消化后的組織懸液中加入氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置20 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；吸取上清，加入等體積預冷的異丙醇，混勻，室溫靜置20 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；棄上清留沉淀，加入1 ml預冷的75%乙醇，混勻，4℃ 12 000 r/min離心5 min，棄去乙醇；沉淀物靜置30 min，根據沉淀大小分另加入10～30 ml焦碳酸二乙酯(DEPC)水，充分溶解；紫外分光光度儀檢測260 nm處OD值，計算RNA的濃度和純度，-80℃冰箱保存備用。將提取到的總RNA按照反轉錄試劑盒的說明書進行RNA逆轉錄，合成cDNA。按照qRT-PCR 試劑盒說明書進行PCR。qRT-PCR用于檢測假手術組和AMI組心肌組織中miR-374的表達水平及各組COL1A1和Ⅲ型膠原(COL3)A1 mRNA表達水平及轉染miR-374 mimics對IL-10 mRNA表達的影響。反應為20 μl體系，各添加物為DNA 2 μl、上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、2×SYBR Premix Taq TM 10 μl、Rox reference Dye Ⅰ 0.4 μl、dH2O 6.8 μl。

1.6Masson三色染色 切取心肌標本，采用固定液固定，浸蠟包埋，固定于切片機上切成3～5 μm薄片，嚴格按照說明書采用Masson三色染色對各組MF程度進行分析。

1.7細胞培養和轉染 CFs于37℃、5% CO2培養箱中培養，1～2 d傳代1次，取2～4代細胞進行實驗，按照說明書分別轉染miR-374 mimics和陽性對照miRNA mimics。

1.8熒光素酶報告分析 構建IL-10野生型3′-非翻譯區(UTR)熒光素酶報告基因質粒pMIR-WT，并以pMIR-WT質粒為模板，利用PCR搭橋法構建其潛在結合位點熒光素酶突變型質粒(pMIR-Mut)。將miR-374 mimics，內參海腎熒光素酶及pMIR-WT和pMIR-Mut報告基因質粒共轉染進CFs細胞中，在細胞培養箱中培養36 h后，用裂解緩沖液裂解細胞后分析雙熒光素酶活性。

1.9Western印跡檢測 采用含50 mmol/L Tris-HCl (pH7.4)，150 mmol/L NaCl，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶抑制劑及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液分離蛋白質，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，AMI組和AMI+miR-374組心肌組織中IL-10、P65和P50蛋白的表達按說明書進行Western印跡檢測。

1.10統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1miR-374在AMI患者及AMI小鼠中的表達水平 AMI患者血清中miR-374的表達水平(1.833±0.231)顯著高于健康對照組(1.000±0.211，t=20.772，P<0.001)；miR-374在AMI組小鼠心肌組織中的表達(2.632±0.311)顯著高于假手術組(1.000±0.282，t=10.836，P<0.001)。

2.2miR-374與AMI小鼠心功能的相關性 AMI組LVEF和FS顯著低于假手術組(P<0.01)，LVDd和LVDs顯著高于假手術組(P<0.01，<0.05)；而與AMI組相比，AMI+miR-374組LVEF和FS顯著降低(P<0.01)，LVDd和LVDs顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.3miR-374與AMI小鼠心肌組織中Caspase3和Caspase8活性的相關性 AMI組Caspase3和Caspase8活性顯著高于假手術組(P<0.01)。與AMI組相比，AMI+miR-374組Caspase3和Caspase8活性顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.4miR-374對AMI小鼠心臟纖維化的影響 相比AMI組，AMI+miR-374組左心室纖維化程度增加(圖1)；AMI+miR-374組心肌組織中COL1A1和COL3A1 mRNA表達水平(3.32±0.54,4.11±0.52)顯著高于AMI組(1.52±0.23，1.85±0.20，P<0.01)。

表1 各組心功能、Caspase3和Caspase8活性、心臟纖維化比較

與假手術組比較：1)P<0.01,2)P<0.05；與AMI組比較：3)P<0.01；下表同

圖1 miR-374對AMI小鼠心臟纖維化的影響(Masson三色染色,×50)

2.5miR-374對IL-10的靶向調控作用 通過microRNA靶基因數據庫進行篩選，預測IL-10是miR-374的潛在靶基因(圖2)。雙熒光素酶檢測結果顯示，pMIR、pMIR-WT、pMIR-Mut各組熒光素酶活性分別為1.00±0.21、0.30±0.02、1.24±0.15，miR-374mimics可明顯抑制pMIR-WT熒光素酶活性(P<0.01)，而對pMIR-Mut熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。qRT-PCR檢測發現，相比對照組(1.00±0.15)，轉染了miR-374mimics的CFs細胞中IL-10 mRNA表達水平(0.41±0.03)顯著降低(P<0.01)。這些結果驗證了IL-10是miR-374的靶基因，并且miR-374可抑制其表達。Western印跡結果顯示，相比AMI組，AMI+miR-374組心肌組織中IL-10蛋白表達顯著降低，而P65和P50蛋白磷酸化增加(圖3)。

圖2 利用TargetScansl預測IL-10為替在靶基因

圖3 miR-374對IL-10、P-P65、P-P50的靶向調控作用

3 討 論

MF是心肌梗死后VR的重要病理過程，主要表現為CFs的異常增殖活化和過度的膠原沉積〔6〕。MF的發展會造成心肌變硬，心肌收縮和舒張功能受損，心臟功能不全，甚至導致心力衰竭。而在這一過程中，TNF-α，IL-1，IL-6等炎癥因子發揮了重要的促纖維化作用。miR是一類長度為19～25 nt的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶基因的3′-UTR區域完全或不完全配對，從而在轉錄后抑制基因表達。miR參與調控細胞的增殖、遷移、分化和凋亡，在心血管、腫瘤等多種疾病中發揮著重要作用〔7〕。當前研究顯示，部分特異性的miR與MF的發生及發展密切相關。van Rooij等〔8〕發現miR-29可通過下調膠原的合成抑制心臟MF的發展。miR-101a能抑制CFs的增殖、分化和遷移并改善心臟功能。還有報道指出，miR-1、miR-132、miR-133可抑制MF，miR-15、miR-21、miR-199可促進MF。雖然目前已報道了許多與MF有關的miR，但miR-374在AMI誘導的MF中作用尚不明確。本研究說明miR-374過表達可促進AMI小鼠心肌細胞凋亡及心臟功能的惡化。

當前研究顯示，在MF過程中，COL1和COL3是心肌間質中過度沉積的主要膠原，是反映MF的一個主要指標〔9〕。本研究表示miR-374過表達可上調COL1和COL3濃度。同時miR-374在AMI小鼠MF的發展中發揮促進作用。

炎性因子的異常表達與心血管疾病的發生及發展密切相關〔10〕。心肌梗死后，隨著各種炎性因子的激活，持續過度的炎癥反應將造成心肌損傷，導致MF。IL-10又稱細胞因子合成抑制因子，是一種炎性細胞抑制因子。IL-10具有抑制中性粒細胞和單核細胞等產生趨化因子和炎性因子的作用，抑制γ-干擾素、IL-1、IL-2、IL-8和TNF-α等炎性細胞因子的表達，激活基質金屬蛋白酶(MMP)組織抑制因子(TIMP)1并抑制MMP9的合成，在免疫調節和炎癥反應的多個環節中發揮抗炎作用〔11〕。有研究顯示，IL-10在冠狀動脈疾病中可穩定斑塊，抑制斑塊的形成，發揮保護作用〔12〕。Mallat等〔13〕發現IL-10缺陷的大鼠動脈粥樣硬化易感性明顯升高，而通過外部給予IL-10后，其動脈粥樣硬化損傷區域明顯降低。本研究驗證了IL-10是miR-374的靶基因，表明miR-374可通過靶向調控IL-10而參與AMI誘導MF的病理過程中。

IL-10可抑制核因子激活的B細胞的κ-輕鏈(NF-κB)增強的表達，而NF-κB是TNF-α、IL-1β等多種炎性因子激活的共同媒介。這些激活的炎性因子又可進一步促進NF-κB的表達，導致炎性因子呈級聯放大趨勢不斷被激活，使心肌損傷，纖維化等病變程度不斷加重。NF-κB是一種多向調節功能的轉錄因子，其構成亞基分別是NF-κB1(p50/p105)，NF-κB2(p52/p100)，v-rel網狀內皮細胞過多癥病毒癌基因同源物(Rel)A(p65)，RelB和c-Rel。NF-κB是以同源或異源二聚體的形式存在，其中主要是p65/ p50異源二聚體。在靜息細胞內，NF-κB二聚體在胞質中與κB抑制劑(IκB)結合形成無活性的三聚體。當細胞受到細胞因子、細菌、病毒、心肌組織的缺血性損傷和紫外線等外界刺激后，IκB蛋白磷酸化，泛素化，IκB蛋白降解后，NF-κB二聚體得以釋放進而活化后，轉移到細胞核中并與靶基因結合以促進靶基因的轉錄。NF-κB在心肌細胞、CFs和血管平滑肌細胞中均有表達，在心肌缺血再灌注損傷、MF、心肌細胞凋亡、心力衰竭等心血管疾病的病理過程中發揮重要作用〔14〕。有報道指出，NF-κB可介導血管緊張素受體阻滯劑Ⅱ，TNF-α促進CFs增殖及膠原的表達。Frantz等〔15〕發現心肌梗死后10 w的大鼠心肌細胞中，NF-κB被持續慢性激活。Ritchie〔16〕研究顯示，NF-κB在急性冠脈綜合征患者中被顯著激活，其激活程度與冠心病嚴重程度密切相關。本研究表示，miR-374可通過抑制IL-10的表達促進NF-κB信號通路的激活。而NF-κB介導的炎性反應可促進MF，提示miR-374在AMI誘導的MF過程中發揮促進作用。

綜上，miR-374可能通過結合IL-10的3′-UTR從而抑制IL-10表達并促進NF-κB活化。過表達miR-374可導致AMI小鼠心臟功能下降，促進小鼠在AMI后MF的發展。因此，miR-374可能為AMI誘導MF的防治提供了新的研究方向與治療靶點。