銀杏葉提取物對甲狀腺癌細胞PI3K/Akt信號通路的影響及意義

劉鐵鋼 聞春艷 申鉉三

(1內蒙古民族大學附屬醫院普外科，內蒙 通遼 028000；2吉林大學中日聯誼醫院病理科)

甲狀腺癌是臨床最為常見的人體內分泌器官惡性腫瘤，其發病率逐年增高，病程進展緩慢具有很強的隱匿性〔1～3〕。銀杏葉能活血化瘀、清除氧自由基、保護細胞膜穩定；其提取物含銀杏總黃酮、銀杏內酯能抗氧化降血脂，近年來發現其在抗腫瘤方面有一定的療效，對肝癌、胃癌、甲狀腺癌及卵巢癌癌細胞具有殺傷作用，但其作用機制尚不清楚〔4～7〕。本實驗探究銀杏葉提取物對甲狀腺癌TPC-1細胞株磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料和設備 甲狀腺癌TPC-1細胞株購于中國醫學科學院細胞庫；銀杏葉提取物購于上海研生生化試劑有限公司；RPMI1640培養基、胎牛血清、抗生素、胰酶、96孔培養板、6孔培養板、25 cm2培養瓶購于Hyclone公司；噻唑藍(MTT)試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；兔抗PI3K、Akt、硫酸化(p)-Akt和鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3購于CST有限公司；Trizol購于長春鼎國生物有限公司；Taq酶、marker和實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購于北京鼎國生物有限公司；引物購于上海生物工程有限公司。酶標儀、ABI7300實時熒光定量PCR儀、Biometra PCR擴增儀(Biotek公司，美國)。

1.2細胞培養和分組 將購買的凍存甲狀腺癌TPC-1細胞株復蘇， 置于25 cm2培養瓶中(含 10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI1640培養基)；放入37℃、5%CO2體積分數的孵箱中孵育；次日換液，待細胞鋪滿瓶壁80%～90%時進行傳代分組。分為空白組、銀杏葉低劑量組(5 μmol/L)、銀杏葉中劑量組(10 μmol/L)、銀杏葉高劑量組(20 μmol/L)，實驗分為3個時間點：培養24 h、48 h和72 h。

1.3MTT檢測細胞增殖活性 將鋪滿瓶壁80%～90%甲狀腺癌TPC-1細胞用0.25%胰酶消化接種于96孔培養板，每孔90 μl(3 000～5 000個細胞)設置5個復孔為一組，然后空白組、銀杏葉低、中、高劑量組分別加入10 μl同體積的培養液及低、中、高劑量銀杏葉提取物，培養24 h、48 h和72 h；4組分別培養至相應時間點，每孔分別加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，繼續培養4 h后棄上清液，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)震蕩10 s，通過酶標儀在570 nm的波長處檢測OD值；細胞增殖率=(細胞組OD值/參照OD值)×100%。

1.4免疫組織化學法檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白和凋亡蛋白caspase-3的蛋白含量 細胞接種于6孔培養板，設置5個復孔為一組，事先在培養板中放入24 mm×24 mm的蓋玻片，使得細胞爬片生長，待細胞鋪滿50%～70%時，4組按劑量加入試驗用藥培養24 h、48 h和72 h；培養至相應時間點終止培養，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗爬片5 min/3次，用冷丙酮固定15 min，晾干準備進行SP法免疫組織化學染色，染色結果細胞質陽性棕黃色，細胞核用蘇木精復染為藍色。采用Motic Images Advanced3.2圖像分析軟件對細胞半定量分析，結果以光密度值(OD值)表示，OD值越大陽性表達越強。

1.5實時熒光定量PCR法檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白和凋亡蛋白caspase-3 mRNA水平 用Trizol提取細胞總RNA，所有樣本基因擴增3次，檢測PI3K、Akt、p-Akt和凋亡蛋白caspase-3 mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平。

1.6統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件進行F檢驗和t檢驗。

2 結 果

2.14組甲狀腺癌TPC-1細胞株MTT細胞增殖率的比較 與空白組比較，銀杏葉提取物低、中、高劑量組MTT細胞增殖率均明顯下降，銀杏葉提取物能夠抑制甲狀腺癌TPC-1細胞株增殖，且隨時間延長和劑量增加效果更為顯著，各時間點間、各劑量組間均差異顯著(P<0.05)；見表1。

表1 4組培養不同時間點甲狀腺癌TPC-1細胞株MTT細胞增殖率的比較

與空白組比較：1)P<0.05，與銀杏葉低劑量組比較：2)P<0.05;與銀杏葉中劑量組比較：3)P<0.05；表2同

2.24組甲狀腺癌TPC-1細胞株PI3K、Akt、p-Akt、caspase-3的蛋白和mRNA含量比較 與空白組比較，銀杏葉低、中、高劑量組PI3K和p-Akt的蛋白和mRNA含量均顯著降低且隨劑量增加效果更為顯著(P<0.05)，銀杏葉低、中、高劑量組caspase-3的蛋白和mRNA含量均顯著升高且隨劑量增加效果更為顯著(P<0.05)，銀杏葉低、中、高劑量組Akt蛋白和mRNA含量未見顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 4組甲狀腺癌TPC-1細胞株PI3K、Akt、p-Akt、caspase-3的蛋白和mRNA含量比較

3 討 論

甲狀腺癌發病機制復雜，目前尚不清晰，從分子病理學角度觀察，其病變發生、發展與其他惡性腫瘤有相似之處〔1,8,9〕。很多惡性腫瘤的發生與機體內復雜的信號通路密切相關，因此信號通路的相關蛋白就是作用的關鍵所在〔10〕。

PI3K/Akt信號通路在腫瘤中失調控，通路相關蛋白失平衡就會刺激腫瘤細胞增殖活性和加速腫瘤細胞侵襲轉移，目前PI3K/Akt信號通路已被發現其在乳腺癌、結腸癌等有調控作用〔10～12〕。在腫瘤發病機制的探索階段，細胞凋亡是常用研究手段，caspase-3是凋亡促進基因，它是細胞凋亡的核心執行者也就是凋亡的共同通路，caspase-3的活化能刺激誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞增殖、分化〔13,14〕。

已有研究證實銀杏葉提取物在肝癌、胃癌、卵巢癌中的抗癌作用，但作用機制不甚明了〔6，7，15〕。本文結果提示，銀杏葉提取物抑制甲狀腺癌TPC-1細胞株的增殖，可能與調控PI3K/Akt信號通路和促進細胞凋亡密切相關，并可見濃度依賴趨勢。