干擾素α和胸腺五肽協同干預對HepG2.2.15細胞APOBEC3A和APOBEC3B mRNA表達的影響

熊 芳，高 耀，馬艷品，于樂樂，譚炳琴，鮑旭麗，閭 軍

首都醫科大學附屬北京佑安醫院 肝病與腫瘤生物治療科，北京 100069

HBV共價閉合環狀DNA (cccDNA)是病毒復制過程中產生的一種重要復制中間體，在細胞核內積聚，現有抗病毒藥物不能清除, 是肝細胞持續感染和抗病毒治療后產生耐受和停藥后復發的關鍵[1]。既往研究[2]發現IFNα和胸腺五肽(thymopentin，TP5)可協同作用降低HepG2.2.15細胞內cccDNA，但具體的機制未明。載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽3(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3, APOBEC3)家族包含7位成員，包括APOBEC3A(簡寫為A3A，下同)、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G和A3H，具有胞苷脫氨基活性，其中多個成員與機體抵抗病毒感染的先天性免疫有關[3]。IFNα直接作用于細胞IFNα/β受體從而上調APOBEC3A表達；而淋巴毒素β-受體(1ymphotoxin-β receptor，LTβR)特異性激動劑可激活LTβR從而上調APOBEC3B表達。上調的APOBEC3A/B均可通過HBV核心蛋白引導而作用于cccDNA脫氨基作用，從而在細胞內切酶作用下降解cccDNA[4]。本研究觀察IFNα和TP5協同干預HepG2.2.15細胞APOBEC3A、APOBEC3B基因表達水平的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 轉染HBV全基因組的人肝癌細胞系HepG2.2.15細胞由本院肝病研究所保存；IFNα為人IFNα-1b注射液，購自北京三元基因工程有限公司，TP5購自北京雙鷺公司產品。APOBEC3A、APOBEC3B及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)引物由上海捷瑞生物工程有限公司生物公司合成。DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒購自德國Qiagen公司，plasmid safe DNase Ⅰ購自美國Epicentre公司，TRIzol試劑購自美國Sigma公司，反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，SYBR Premix Ex Taq試劑購自日本TaKaRa公司。

1.2 細胞培養 HepG2.2.15細胞在DMEM培養基加入10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(0.1 mg/ml)，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

1.3 細胞處理 取處于對數生長期的5×104個HepG2.2.15細胞接種于48孔板中，分別設立空白對照組、IFNα組、TP5組及IFNα聯合TP5組，每組設立3個復孔。分別處理12、24、48和72 h收集細胞。IFNα的濃度為2、5 KU/ml，TP5的濃度為5、10 μg/ml。

1.4 cccDNA的檢測 用DNeasy Blood & Tissue Kit提取細胞DNA, DNA經plasmid safe DNase Ⅰ處理，利用Taqman實時定量PCR檢測cccDNA。具體的引物和詳細方法見參考文獻[2]。

1.5 反轉錄實時定量PCR法檢測APOBEC3A、APOBEC3B的表達 應用Trizol試劑提取細胞總RNA。取2 μl測定樣品在260 nm和280 nm的A值，確定RNA的濃度，A260/A280比值在1.8～2.0視為抽提RNA無蛋白污染。將總RNA反轉錄為cDNA，反應體系如下： 5×Reverse Transcription Buffer 2 μl，RNase Inhibitor 0.5 μl，Reverse Transcriptase 0.5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，隨機引物 1 μl，Nuclease-free water 4 μl，RNA模板(20 ng/μl) 1 μl，總反轉錄體系為10 μl。反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。將反轉錄產物稀釋10倍，-80 ℃保存。

利用SYBR實時定量PCR法對APOBEC3A、APOBEC3B進行定量檢測，PCR反應體系如下：SYBR Premix Ex Taq 10 μl ，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μl，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μl，cDNA 2 μl，滅菌水7 μl，反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。APOBEC3A上游引物：5′-AGATGGAGTCTGGTACTGTCG-3′，APOBEC3A下游引物：5′- GAGGCAGGAGAGTAGCGT -3′；Tm值分別為60.2 ℃、59.9 ℃，擴增片段大小為98 bp。 APOBEC3B上游引物：5′-GACAGGGACAAGCGTATCTAAG-3′，APOBEC3B下游引物：5′-TCACTTCATAGCACAGCCAAG -3′；Tm值分別為59.5 ℃、59.8 ℃，擴增片段大小為149 bp。 GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH下游引物： 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG A-3′；Tm值分別為63.0 ℃、63.1 ℃，擴增片段大小為138 bp[4]。目的基因和內參基因融解曲線均可見單一峰。目的基因與管家基因的擴增效率均為99%。應用2-△△CT法對目的片段的相對表達水平進行分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFNα對APOBEC3A、APOBEC3B mRNA表達的影響

筆者前期研究[2]發現IFNα組可降低HepG2.2.15細胞cccDNA水平，但是只在IFNα濃度高達5 KU/ml，作用時間為24 h時明顯(圖1a)。為此，觀察了2、5 KU/ml IFNα作用于HepG2.2.15細胞在不同時間點對APOBEC3A、APOBEC3B表達的影響。如圖2所示，2 KU/ml IFNα與空白對照組相比，在12、24、48和72 h均能提高APOBEC3A的表達水平(P值均<0.001)；5 KU/ml IFNα與空白對照組相比，在12、24、48和72 h亦能提高APOBEC3A的表達水平(P值均<0.001)。 APOBEC3B的表達水平未見升高。

注：*與空白對照組相比，P<0.001。

注：*與空白對照組相比，P<0.001。

2.2 TP5對APOBEC3A、APOBEC3B mRNA表達的影響 筆者前期研究發現低濃度5 μg/ml TP5組不能降低HepG2.2.15細胞cccDNA水平，而較高濃度10 μg/ml TP5組能降低HepG2.2.15細胞cccDNA含量(圖1b)。觀察了5、10 μg/ml TP5作用于HepG2.2.15細胞在不同時間點對APOBEC3A、APOBEC3B表達的影響。結果發現，與空白對照組相比未見明顯變化(P值均>0.05)(圖3)。APOBEC3B的表達未見變化。

圖3 不同濃度TP5干預對APOBEC3A mRNA水平的影響

2.3 IFNα聯合TP5對APOBEC3A、APOBEC3B mRNA表達的影響 筆者前期研究發現2 KU/ml IFNα聯合5、10 μg/ml TP5組作用于HepG2.2.15細胞72 h可顯著降低cccDNA水平(圖1c)。觀察了2 KU/ml IFNα聯合5、10 μg/ml TP5組作用于HepG2.2.15細胞在不同時間點對APOBEC3A、APOBEC3B表達的影響。如圖4所示，2 KU/ml IFNα聯合5 μg/ml TP5與空白對照組相比,在12、24、48和72 h均能提高APOBEC3A的表達水平(P值均<0.001)；2 KU/ml IFNα聯合10 μg/ml TP5與空白對照組相比，在12、24、48和72 h亦能提高APOBEC3A的表達水平(P值均<0.001)；與2 KU/ml IFNα相比，2 KU/ml IFNα聯合5 μg/ml TP5組和2 KU/ml IFNα聯合10 μg/ml TP5組在12、24、48和72 h均可明顯提高APOBEC3A的表達水平(P值均<0.001)。APOBEC3B mRNA表達未見變化。

3 討論

筆者前期研究[2]發現IFNα和TP5可協同作用降低HepG2.2.15細胞內cccDNA，具體的機制未知。本研究表明IFNα聯合TP5可作用于HepG2.2.15細胞，顯著提高APOBEC3A的表達來降解cccDNA。為臨床上TP5聯合IFNα的抗HBV作用提供了新機制。

注：*與空白對照組相比，P<0.001；#與2 KU/ml IFNα組相比，P<0.001。

APOBEC3A、APOBEC3B屬于APOBEC3家族，是一類可抑制逆轉錄病毒復制的酶。APOBEC3家族的所有成員都具有脫氨基作用。體內、體外實驗和臨床試驗表明IFNα可以誘導部分APOBECs表達上調[5-7]。研究[8]表明IFNα可通過上調APOBEC3A的表達來發揮對HBV cccDNA的脫氨基作用，在cccDNA上形成脫嘌呤嘧啶位點，使得cccDNA被核酸裂解酶識別而降解，從而顯著降低細胞內cccDNA。但是這種作用，在IFNα較高濃度時明顯。

本研究發現低濃度的TP5單獨對細胞內APOBEC3A的表達并無影響。TP5降低cccDNA的具體機制可能不是通過提高細胞內APOBEC3A這條通路，具體的機制還需要進一步研究。但是TP5聯合IFNα可顯著提高細胞內APOBEC3A mRNA的表達，與IFNα單獨提高APOBEC3A的表達相比，兩者差異有統計學有意義。提示在臨床實踐中，TP5聯合IFNα對HBV的治療是有益的。但是本實驗方法只是局限于real-time PCR方法所測，可進一步完善蛋白水平檢測數據和基因沉默實驗，將會使結果更加全面。

TP5是一類免疫調節劑，可增強機體非特異性免疫功能，在我國廣泛用于慢性乙型肝炎的治療。可增強慢性肝炎患者CD4+、CD8+T淋巴細胞成熟及分化，改善T淋巴細胞亞群水平及比例，通過增加CD4+/CD8+比值并延長細胞亞群的壽命，增強機體免疫力，通過活化輔助性T淋巴細胞并誘導抑制性T淋巴細胞來發揮作用[9]。本研究表明，TP5和IFNα的聯合作用可降解cccDNA, 其中一個的機制是通過協同作用提高細胞內APOBEC3A mRNA的表達。