紫花蕓豆肽修復H2O2對HepG2細胞的氧化應激損傷

馬 萍，程天賦，郭增旺，周 義，王 欣，曹冬梅

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

蕓豆學名菜豆，是豆科菜豆屬的小宗雜糧作物[1]，是栽培面積僅次于大豆的食用豆類作物之一[2]。紫花蕓豆是黑龍江省種植量最大的一個品種，其富含蛋白質、多糖、花色苷、維生素等多種營養成分，還含有皂苷、尿毒酶等獨特成分，具有提高人體自身免疫能力、激活淋巴T細胞、抑制腫瘤細胞發展、促進脫氧核苷酸合成等功能，是開發高檔食品及功能性食品的優質原料[3-5]。

當機體受到外源性或內源性氧化物質損傷時，體內自由基產生和清除的動態平衡就會遭到破壞，從而引起ROS在體內堆積并產生細胞毒性作用[6]。自由基水平過高時會氧化細胞膜、代謝酶系、蛋白質和DNA等物質，還會誘導細胞凋亡，對機體的細胞及器官造成損傷[7-9]。 研究表明，自由基與衰老、炎癥、癌癥、心血管疾病等都有密切的關系[10-12]，因此，開發具有清除自由基的功能性食品和藥物日益受到重視。抗氧化肽是指具有抗氧化功能的生物活性肽，由于具有分子質量小、生物活性高、抗原性低、易吸收等特點而被廣泛研究[13-14]。大量研究表明，食源性蛋白酶解物如大米蛋白肽、小麥蛋白肽、大豆蛋白肽等具有抗氧化活性，能夠清除自由基[15-21]，但是對生物活性肽是如何通過調控凋亡蛋白通路進行協作發揮抗氧化活性的研究還較少。本課題組前期制備了紫花蕓豆抗氧化肽，并通過體外實驗評價了其抗氧化活性，發現雙酶水解得到的紫花蕓豆肽（Phaseolus vulgarispeptides，PVPs）具有體外抗氧化活性[21]。為了系統準確地評價PVPs的抗氧化活性及其作用機制，本實驗采用H2O2誘導HepG2細胞構建細胞氧化應激損傷模型，采用水溶性四唑鹽法（WST-1法）檢測細胞增殖率，流式細胞儀檢測胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測胞內抗氧化物酶系活性，Western blot法檢測PVPs對細胞凋亡通路的影響，以此評價PVPs的抗氧化活性并探索其作用機理，從而為PVPs的功能性食品開發和抗氧化活性肽的作用機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆產地黑龍江省齊齊哈爾市依安縣，蛋白質量分數19.17%，由國家雜糧工程技術研究中心提供；紫花蕓豆蛋白由本實驗室通過堿提酸沉法[22]制得， 純度92.2%。

人肝癌細胞HepG2 哈爾濱醫科大學；DMEM高糖液體培養基、青霉素/鏈霉素 美國Hyclone公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶消化液 美國Gibco公司；1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、BCA蛋白質濃度測定試劑盒（增強型）、RIPA細胞裂解液、丙二醛（malonicdialdehyde，MDA）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、凝膠試劑盒 碧云天生物技術研究所；兔抗p53單克隆抗體、兔抗Caspase-3單克隆抗體、鼠抗Caspase-3單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記的抗鼠二抗 美國CST公司。

1.2 儀器與設備

CO2細胞培養箱、高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；多功能酶標儀 上海三科儀器有限公司；FACS Calibur流式細胞儀 美國BD公司；EVOS熒光顯微鏡 美國Life Technologies公司；半干轉膜儀、電泳槽、ChemiDoc XRS＋化學發光成像系統 美國Bio-Rad公司；TS-2000A多用脫色搖床 海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PVPs的制備

PVPs參照課題組前期的研究方法[21]制備。工藝路線為：紫花蕓豆蛋白→加水（底物質量分數為7%）→熱處理（95 ℃、10 min）→冷卻→調至pH 10、50 ℃→加質量分數7%胰蛋白酶→恒溫恒pH值水解4.5 h→滅酶（95 ℃、10 min）→冷卻→調至pH 9、60 ℃→加質量分數7%堿性蛋白酶→恒溫恒pH值水解3 h→滅酶（95 ℃、10 min）→透析脫鹽12 h→冷凍干燥→PVPs

所得PVPs的純度為93.2%，分子質量分布集中在6 kDa以下。

1.3.2 細胞培養與分組

將HepG2細胞置于含有質量分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM（高糖）培養基中，于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養，待細胞數量達到80%～90%后吸去培養液，用PBS沖洗 一次，加入1 mL胰蛋白酶消化3 min，進行傳代培養。將處于對數生長期的細胞接種于培養板中培育4 h后更換培養基，除去未貼壁細胞并對其進行分組[23]。正常對照組：不加PVPs和H2O2干預處理，只加入與實驗組PVPs和H2O2相同體積的PBS；氧化應激模型組：不加PVPs干預，加入與實驗組PVPs相同體積的PBS溶液培養24 h后，加入終濃度為2 mmol/L H2O2溶液刺激1 h；實驗組：PVPs低劑量組（PVPs-L）、PVPs中劑量組（PVPs-M）、PVPs高劑量組（PVPs-H），采用終質量濃度分別為50、100、200 μg/mL PVPs干預24 h后，加入終濃度為 2 mmol/L H2O2溶液刺激1 h。

1.3.3 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞增殖率的影響

參照臧琳等[24]的方法并略加改動。采用WST-1法檢測細胞增殖率。選取對數生長期的HepG2細胞接種于96 孔板內，每孔體積100 μL，接種密度為2.0h 103個/mL， 置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，按照1.3.2節分組方法處理細胞，棄培養液，每孔加入10 μL的WST-1溶液，混勻，于細胞培養箱內孵育2 h，振蕩充分混勻后，用酶標儀以450 nm為檢測波長、630 nm為參考波長測定吸光度，按下式計算各組細胞存活率。

1.3.4 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞胞內ROS水平的影響

參考Wang Wei等[25]的方法并略加改動。選取對數生長期的HepG2細胞接種于6 孔板內，每孔體積2 mL，接種密度為1.0h 105個/mL，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，按照1.3.2節分組方法處理細胞后，每孔加入終濃度10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，37 ℃避光反應20 min后吸去探針，用預冷的PBS洗滌細胞2 次，隨后采用胰蛋白酶消化液消化細胞，離心除去上清液，PBS重懸細胞，并采用流式細胞儀測定活細胞的ROS含量。

1.3.5 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞MDA水平的影響

參考劉艷等[26]的方法，并略加改動。選取對數生長期的HepG2細胞接種于6 孔板內，每孔體積2 mL，接種密度為1.0h 105個/mL，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，按照1.3.2節分組方法處理細胞后，每孔加入100 μL細胞裂解液使細胞裂解，于4 ℃、1 600hg下離心10 min，取上清液作為樣本，參照MDA測定試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書對細胞內的MDA和蛋白質進行定量測定。

1.3.6 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞胞內抗氧化物酶系活力的影響

參照臧琳等[24]的方法并略加改動。選取對數生長期的HepG2細胞接種于6 孔板內，每孔體積2 mL，接種密度為1.0h 105個/mL，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，按照1.3.2節分組方法處理細胞后，用預冷PBS洗滌1 次，棄去PBS，刮下細胞轉移到1.5 mL離心管中，離心棄上清液，加入細胞裂解液，4 ℃，12 000hg離心10 min。取上清液按照試劑盒說明書檢測SOD、GSH-Px及過氧化氫酶（catalase，CAT）活力，余下部分采用BCA法進行蛋白濃度測定。

1.3.7 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞的胞內凋亡蛋白表達量的影響

參照Han等的方法[27]并略加改動。選取對數生長期的HepG2細胞接種于6 孔板內，每孔體積2 mL，接種密度為1.0h 105個/mL，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，按照1.3.2節分組方法處理細胞后，加入100 μL RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白濃度測定，配制質量分數10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，恒壓50、80、120 V電泳各30 min，半干法轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，暗室中加發光染料底物混合物1 mL于膜上顯色1 min，曝光顯影，結果采用Image Lab軟件進行定量分析。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用平均值±標準差表示。實驗數據使用SPSS 19.0軟件進行統計分析，用方差分析法進行顯著性檢驗，組間比較采用Tukey法進行。

2 結果與分析

2.1 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞存活率的影響

圖 1 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞氧化損傷的抑制作用Fig. 1 Effect of PVPs on viability of HepG2 cells induced by H2O2

由圖1 可知，H2O2誘導的模型組細胞存活率僅為（6 5.2 4 f 3.0 1）%，與正常組相比顯著下降 （P＜0.05），這表明H2O2誘導HepG2細胞構建的氧化應激模型成功；與模型組相比，PVPs中、高劑量組可以顯著提高H2O2構建氧化應激模型的細胞存活率（P＜0.05），顯著緩解H2O2引起HepG2細胞的增殖抑制，且呈現劑量-效應關系。H2O2是構建氧化應激細胞模型的重要刺激原之一，能直接氧化細胞膜上的蛋白質和脂類物質，還能自由穿透細胞膜，與胞內鐵離子結合反應生成羥自由基等自由基，進而誘導細胞凋亡并造成組織損傷[28]。模型組中的H2O2對HepG2細胞的增殖產生了顯著的抑制作用，但中、高劑量的PVPs培養HepG2細胞后顯著降低了H2O2對細胞存活率的抑制作用。這表明PVPs能在一定程度上對HepG2細胞起到保護作用，能緩解H2O2對HepG2細胞的氧化應激損傷。

2.2 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞胞內ROS含量的影響

圖 2 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞胞內ROS含量的影響Fig. 2 Effect of PVPs on ROS level in H2O2-induced HepG2 cells

當機體受到外界刺激時，巨噬細胞中的線粒體能通過呼吸爆發機制產生少量的ROS，促進其發揮吞噬和酶解的生理功能[29-30]。但在病理條件下，機體內的ROS升高到一定水平且氧化應激機制不足以調控其回歸到正常水平時，將對細胞的核酸、蛋白質、生物膜造成氧化損傷，從而誘導細胞發生損傷和凋亡[31]。在HepG2細胞處理后裝載ROS探針DCFH-DA，并使用流式細胞儀對胞內ROS水平進行檢測，ROS可以氧化胞內無熒光的DCFH轉變成熒光DCF。因此，通常以正常細胞作為內參，以發生熒光信號強度改變的細胞數占總細胞數的比值表征細胞內的ROS水平，偏移量越大代表熒光強度越高，比例越高代表ROS水平越高。由圖2可知，與正常組相比，模型組的ROS含量顯著升高（P＜0.05）；低、中、高劑量的PVPs顯著降低了胞內ROS含量（P＜0.05），且呈現劑量-效應關系。這表明PVPs可以減輕H2O2誘導HepG2細胞胞內ROS含量的升高，從而發揮其抗氧化應激的功能，減輕ROS對細胞和機體引發的氧化損傷。

2.3 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞MDA水平的影響

圖 3 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞MDA濃度的影響Fig. 3 Effect of PVPs on MDA concentration in HepG2 cells induced by H2O2

MDA是生物體內的脂質物質受到自由基氧化而生成的最終氧化產物。ROS極易氧化細胞膜中的不飽和脂肪酸，形成脂質自由基，從而引發脂質過氧化作用導致細胞膜發生損傷，引起MDA水平升高，因此MDA水平直接反映了細胞膜受到自由基氧化損傷的嚴重程度[32]。由圖3可知，H2O2誘導的模型組MDA水平與正常組相比顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量的PVPs均顯著抑制H2O2引起的氧化應激模型細胞MDA濃度的上升（P＜0.05），且呈現劑量-效應關系。模型組MDA水平顯著升高表明其細胞受到ROS刺激后，細胞膜發生嚴重損傷；而PVPs能顯著降低細胞的MDA水平，表明PVPs能對抗ROS引發的脂質氧化作用，具有減輕自由基對機體氧化應激損傷的活性。

2.4 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞抗氧化物酶系活力的影響

圖 4 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞抗氧化物酶系活力的影響Fig. 4 Effect of PVPs on antioxidant enzyme activity in HepG2 cells induced by H2O2

SOD、CAT和GSH-Px均為細胞抗氧化物酶系中的重要組成部分，在機體發揮抗氧化和維護氧化應激動態平衡中發揮著重要的作用[33-34]。SOD能催化過氧陰離子發生歧化反應從而發揮清除自由基的作用；CAT約占CAT體系總量的40%，能催化H2O2生成水和氧氣，是CAT體系的標志性酶；GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，其組成部分中的硒能催化GSH與過氧化物反應，生成無毒的羥基化合物和氧化型谷胱甘肽，促使對機體和細胞有毒有害的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞和機體免受過氧化物的損傷；機體內的抗氧化物酶系活力直接反映了細胞在氧化應激環境下的動態平衡調節能力[35-37]。由圖4可知，H2O2誘導HepG2細胞建立的氧化應激細胞模型的抗氧化物酶系活力與正常組相比均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，PVPs低、中、高劑量組的SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著升高（P＜0.05），且呈現劑量-效應關系。這表明此濃度的H2O2破壞了細胞的氧化調節動態平衡，細胞自身的抗氧化代謝調控能力不足以應付外界刺激，細胞受到嚴重的氧化應激損傷[33]；而在PVPs培養24 h后細胞的抗氧化物酶系活力均顯著提高，表明PVPs能減輕H2O2對細胞抗氧化物酶系的破壞作用，減輕氧化應激損傷并提高對外界氧化應激的調控能力，這也和之前PVPs能減輕H2O2對細胞膜損傷的結果相一致。

2.5 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞凋亡信號通路的影響

圖 5 PVPs對H2O2誘導HepG2細胞Caspase-3、p53蛋白表達量的影響Fig. 5 Effect of PVPs on the protein expression of caspase-3 and p53 in H2O2-induced HepG2 cells

p53蛋白又稱凋亡蛋白，負責維持細胞基因組的完成性、DNA損傷的修復和細胞周期的運行，主要介導DNA損傷后的細胞應激反應[38]。正常細胞內的p53蛋白含量較低，當由于外界環境造成核內DNA損傷時胞內p53表達量上升，調控細胞分裂周期停止于G1期，自我修復發生損傷的基因，若修復失敗則與其他凋亡基因協同誘導細胞發生凋亡[39-40]。Caspases通路在所有細胞發生凋亡時都會被激活，而Caspase-3是細胞發生凋亡的最終執行者。正常細胞內的Caspase-3蛋白處于非激活狀態，當細胞發生凋亡時，Caspase-3蛋白被激活轉化裂解產生能誘導細胞凋亡的活性片段，后者能進入核內激活核酸內切酶，從而使DNA發生裂解，進而誘導細胞凋亡[41-42]。由圖5可知，與正常組相比，模型組胞內Caspase-3和p53表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，PVPs低、中、高劑量組的Caspase-3和p53蛋白表達量均顯著下降（P＜0.05）。本實驗結果表明此濃度的H2O2誘導了HepG2細胞凋亡蛋白的表達，而PVPs能抑制胞內凋亡蛋白的表達，并且與濃度呈現正相關，這和PVPs能顯著緩解H2O2引起HepG2細胞增殖抑制的作用結果相一致。

3 討 論

機體生長代謝過程中產生的自由基具有多種生理功能，如預防感染、激活細胞、信號傳導等。但是過多的自由基能導致機體正常的細胞組織發生病變并引起氧化應激反應，造成蛋白質損傷、DNA突變、細胞膜磷脂層氧化及低密度脂蛋白變性等損傷[43-44]，并促進癌癥、動脈粥樣硬化和糖尿病等疾病的病理學發展[45-47]。自由基衰老學說提出，機體的衰老是自由基在細胞內逐漸積累并引起過度氧化損傷而導致的。大量研究表明，通過膳食補充抗氧化成分能夠增強機體的防御能力，幫助維持機體的氧化動態平衡。蛋白質是食物的重要組成部分，其水解產物具有特殊的生理功能，如大豆蛋白、雞蛋蛋白、花生蛋白、綠豆蛋白等均具有極強的抗氧化能力。PVPs是采用雙酶水解技術從紫花蕓豆蛋白中提取得到的水溶性活性多肽，前期研究結果表明，PVPs具有體外抗氧化活性，但是體內抗氧化活性及其作用機制還尚未可知[21,48]。本實驗為了深入研究開發紫花蕓豆抗氧化生物活性肽，進一步探討了PVPs對HepG2細胞氧化應激損傷中的細胞存活率和抗氧化調節系統的影響。H2O2是一種重要的ROS，性質相對穩定，常作為體外氧化應激損傷的造模藥物。因此，本實驗以HepG2細胞作為研究對象、H2O2為造模藥物誘導建立氧化應激損傷模型，通過細胞存活率、ROS水平、抗氧化物酶系活力及凋亡蛋白表達進行探討，分析PVPs的抗氧化活性及其作用機制。

細胞存活率是表征細胞狀態的基礎指標，直接反映外界刺激對細胞的損傷程度。高濃度ROS能直接損傷HepG2細胞，誘導細胞發生凋亡[39]。由細胞存活率和免疫印跡實驗可知，H2O2誘導能對細胞造成損傷并使其存活率顯著下降，并且能促進細胞內凋亡蛋白p53和Caspase-3表達量的顯著升高。p53蛋白的生理學作用是當DNA發生損傷時，其表達量升高，調控細胞進行自我基因修復，當損傷不可逆時則協同其他凋亡蛋白誘導細胞發生凋亡，而Caspase-3蛋白是細胞凋亡的最終執行者[48-49]。 這表明H2O2能顯著降低細胞存活率，引起胞內DNA的損傷，從而造成p53表達量的升高，并與Caspase-3蛋白發生協同作用，進而誘導細胞凋亡。而PVPs處理HepG2細胞顯著降低了H2O2對其存活率的抑制作用，并且顯著降低了胞內p53和Caspase-3蛋白的表達量。這表明PVPs能在一定程度上對HepG2細胞起到保護作用，能通過抑制其凋亡基因的表達和減輕ROS對胞內DNA的損傷，從而緩解H2O2對HepG2細胞的氧化應激損傷。

機體存在天然的抗氧化系統，一定程度內的氧化應激刺激能被自身機體的抗氧化調節系統所補償，因而不會引起機體的損傷，但當外界氧化應激源的刺激較為強烈并超出自身調節范圍時，細胞和組織就會受到氧化應激損傷[33]。MDA是細胞膜上不飽和脂肪酸被氧化時所生成的重要代謝產物，可作為脂質過氧化程度的測定標準，其水平的高低可間接反映出細胞受自由基損傷的程度。由圖3可知，該濃度下的H2O2顯著提高了細胞的MDA水平，表明HepG2細胞受到了氧化應激損傷。而PVPs處理HepG2細胞顯著降低了H2O2所引起的MDA濃度升高，表明PVPs能夠幫助細胞抵御自由基對其的脂質氧化作用。機體內存在兩類抗氧化系統能夠調控氧化應激反應，即酶抗氧化系統和非酶抗氧化系統[25]。內源性抗氧化物酶SOD、CAT是防止氧化應激產生的第一道防線。由圖4可知，H2O2對HepG2細胞內的抗氧化物酶系具有滅活的作用，當HepG2細胞受到ROS刺激時會造成整個抗氧化防御系統遭到重創，細胞內的抗氧化物酶系SOD、CAT和GSH-Px活力顯著降低，并且MDA水平顯著升高，導致細胞發生不可逆的損傷。而PVPs預培養能顯著上調抗氧化酶活力并降低MDA水平，恢復H2O2引起的氧化應激損傷，保護細胞內源性抗氧化防御系統，這也可能是PVPs發揮抗氧化活性的作用機制。

H2O2能對HepG2細胞造成嚴重的氧化應激損傷。當HepG2細胞遭受ROS刺激后，細胞膜脂質發生氧化反應并生成代謝產物MDA，膜通透性增強，并且對胞內遺傳物質造成破壞，引起p53和Caspase-3凋亡蛋白的表達量升高，進而導致細胞損傷并誘導其凋亡；為了抵抗外界ROS的刺激和恢復胞內氧化還原平衡，內源性的抗氧化物酶系（SOD、CAT和GSH-Px）被大量消耗，最終導致氧化防御系統紊亂。因此，當HepG2細胞受到H2O2刺激后，細胞存活率顯著下降、凋亡通路被激活、MDA和抗氧化物酶系水平顯著改變。而本研究結果顯示，PVPs能顯著提高HepG2細胞的存活率，降低MDA和胞內ROS水平，提高抗氧化物酶活力，降低凋亡蛋白的表達。這表明PVPs能通過降低胞內ROS水平、提高過氧化酶系和抑制凋亡通路的激活緩解氧化應激損傷。

4 結 論

本實驗研究了PVPs對H2O2所誘導的氧化應激損傷模型的細胞存活率、ROS水平、MDA水平、抗氧化物酶系活力和p53、Caspase-3蛋白表達量的影響。結果表明：PVPs能緩解H2O2所引起的HepG2細胞存活率降低，并降低胞內ROS、MDA水平，提高抗氧化物酶系中SOD、CAT、GSH-Px活力，并且下調p53、Caspase-3的蛋白表達量。PVPs對H2O2引起的HepG2細胞氧化損傷具有一定的保護作用，能通過提高細胞存活率、降低胞內的ROS水平、減輕細胞膜脂質的氧化程度、抑制凋亡蛋白的表達和提高胞內抗氧化物酶系的活力，提高機體的抗氧化能力，從而增強對外界氧化應激的調控。