隱匿性HBV感染無償獻血人群KIR基因多態性的特征分析

張 濤, 毛 偉, 王棟芳, 蔣玉林, 楊丹蓉, 尹 丹, 楊 虎, 歐陽熊妍, 譚茜茜

重慶市血液中心 輸血研究所，重慶 400015

采用酶聯免疫吸附法檢測血清中HBsAg是采供血機構用于篩查血液安全的法定檢測方式之一。近年來隨著病毒核酸檢測技術的開展，發現在HBsAg陰性的人群中檢出HBV DNA，這種除“窗口期”外的HBsAg(-)/HBV DNA(+)的感染定義為隱匿性乙型肝炎病毒感染( occult hepatitis B virus infection，OBI) ，主要表現為低病毒載量水平的感染[1]。在OBI的發病機制中，宿主免疫應答是一個不可忽略的因素，其NK細胞在機體免疫監視和抗病毒感染等方面起著重要作用。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)是NK細胞表面的重要受體，是具有高度多態性的多基因家族，通過傳導激活性或抑制性信號調節NK細胞的活性和機體的免疫應答。本研究擬分析無償獻血人群中OBI獻血者的KIR基因多態性特征，探討OBI感染和KIR基因多態性的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年6月-2019年6月重慶市血液中心采集的18～55歲的無償獻血者血液標本，選擇血清學篩查HBsAg陰性而病毒核酸檢測技術[TIGRIS全自動血液核酸檢測儀(美國諾華公司)，運用Pro- cleix Ultrio assay(Chiron Gene-Probe，Emeryville，San Diego，CA，USA)方法進行三聯熒光病毒核酸檢測]篩查HBV DNA陽性，同時經隨訪排除“窗口期”的獻血者作為研究對象(OBI組)。收集所有研究對象的外周血標本5～8 ml，-80 ℃冷凍保存。本研究通過重慶市血液中心醫學倫理委員會審批，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑 PCR擴增儀(9700型，美國ABI)；流式熒光檢測儀Luminex?200(美國Luminex)；血液基因組柱式小量提取試劑盒(批號30327，康為世紀)；KIR基因分型試劑LIFE CODES KIR-SSO TYPING KIT(批號：3006648，美國IMMUCOR)。

1.3 DNA提取 采用柱提法從凍存(-80℃)的全血標本中提取DNA。DNA純度在1.60～2.00，調整DNA濃度為10～50 ng/μl，按照試劑盒說明書操作。

1.4 KIR基因分型 首先進行PCR擴增，程序：95 ℃ 2 min，1個循環；94 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s，40個循環； 72℃ 15 min，1個循環；4 ℃ 結束。取擴增產物進行雜交、洗滌、上機檢測。本方案可檢測出KIR 2DS4在第5外顯子上有22bp缺失的變異體(KIR 2DS4*del，也稱為KIR 1D)。

2 結果

2.1 KIR基因分布情況 OBI組105例患者的平均年齡為(38.5±1.8)歲，其中男65例(61.9%)，女40例(38.1%)，均為漢族，KIR基因分布見表1。105例OBI獻血者均含有的KIR基因有2DL4、3DL2、3DL3和假基因3DP1；F>70%的KIR基因有2DL1、2DL3、3DL1、2DS4和假基因2DP1，其中KIR 2DS4 第5外顯子存在缺失的F為26.3%,F<30%的基因有2DL2、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1。

表1 105例OBI獻血者KIR基因分布

2.2 OBI獻血者與不同地區健康人群的KIR基因分布比較 OBI獻血者與不同地區健康人群的KIR基因分布比較見表2，OBI獻血人群分別與重慶漢族、河北漢族、江蘇漢族和拉薩藏族比較，KIR 2DL3基因表型頻率均降低(χ2分別為9.598、12.236、13.719、10.974，P值均<0.05)(表2)；OBI獻血人群2DL2、2DL5、2DS2、2DS3與烏市維族比較差異均有統計學意義(χ2值分別為16.215、6.981、19.498、11.819，P值均<0.05)；OBI獻血人群2DL2、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4與高加索人比較差異均有統計學意義(χ2分別為22.477、3.877、34.937、6.909、4.271，P值均<0.05)；OBI獻血人群與重慶漢族相比，KIR 2DS4*del頻率升高(χ2=12.911，P<0.05)。

2.3 OBI獻血者與不同病種人群的KIR基因分布比較

OBI獻血人群與長期慢性HBV感染組相比，2DS2、2DS3頻率降低(χ2分別為13.005、8.289，P值均<0.05)，但2DS4、3DL1頻率升高(χ2分別10.032、3.865，P值均<0.05)；OBI獻血人群與強直性脊柱炎組相比，2DL3、2DS3基因表型頻率降低(χ2分別為7.851、16.504，P值均<0.05)；OBI獻血人群與男男同性戀(MSM)HIV-AIDS 組相比，2DS4、3DL1基因頻率升高(χ2分別為15.491、4.475，P值均<0.05)。OBI獻血人群與散發性急性戊型肝炎組相比，2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DS4、3DL2、3DL3、2DP1差異均有統計學意義(χ2分別為4.448、30.934、17.942、15.638、4.227、13.802、32.667、35.653、36.566，P值均<0.05)(表3)。

表2 OBI獻血者與不同地區健康人群的KIR基因表型頻率的比較(%)

注： 與OBI獻血者比較，1)P<0.05。

表3 OBI獻血者與不同病種人群KIR基因表型頻率的比較(%)

注： 與OBI獻血者比較，1)P<0.05。

2.4 OBI獻血者與不同病種人群、不同地區健康人群的KIR 基因型比較 目前發現人類KIR主要有A和B兩種單倍型，其基因數量和種類均不同。單倍型A除了KIR 2DS4之外均是抑制性KIR基因，包括2DL1、2DL3、3DL1、3DL2。單倍型B包含2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1等不同組合的基因。KIR基因是以單體型的形式遺傳，在特定人群中，這些單體型組合形成特定基因型，包括AA、BX(AB和BB)。具體可通過國際等位基因網站http://www.allelefrequencies.net/kir6001a.asp輸入各個KIR基因檢測的結果，由系統自動判別每一例KIR的基因型。

105例OBI獻血者中共發現21種KIR基因型，均可指定ID號。其中基因型AA1最為常見(49.5%)，其次為BX2(18.1%)，有12種基因型在該人群中僅出現1次(表4)。單倍體 A 在 OBI獻血者和強直性脊柱炎、不同地區健康對照組所占的比例與單倍體B比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

3 討論

KIR是一類表達于NK細胞和某些T淋巴細胞表面的重要受體，通過識別和結合HLA-Ⅰ類分子，傳遞活化或抑制信號來調節NK細胞的功能和殺傷活性，在抗病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病等的發生發展中起著重要作用[14]。KIR分子具有高度多態性，遺傳基礎源于KIR基因多態性，表現在不同的單體型中，KIR基因數量和種類均可能不同，是繼HLA之后發現的具有高度多態性的免疫調節基因家族。有研究[15]報道，KIR基因多態性將影響到其與配體結合的特異性和穩定性，有可能影響HBV感染后的機體免疫反應及其臨床預后。

OBI是HBV感染中的一種特殊類型，因其血清中病毒載量低而不易被發現，成為臨床和流行病學的一大難題[16]。近年來，采供血系統為提升血液安全逐漸采用核酸篩查技術進行經血傳播疾病的排除。本研究中，不能直接檢測獻血者肝臟組織中的HBV DNA，因而將血清學檢測 HBsAg陰性而核酸檢測技術篩查HBV DNA陽性的獻血者定義為OBI獻血者。本研究首次關注了無償獻血人群中OBI獻血者的KIR基因多態性特征，在105例OBI獻血者中檢出了KIR目前已知的16種基因，包括 KIR 2DL1-5、2DS1-5、3DL1-3、3DS1、2DP1、3DP1，以及KIR 2DS4 等位基因第5外顯子存在 22 bp 缺失而產生無激活效應的變異體 KIR 2DS4*del?？梢钥闯?，OBI獻血者中抑制性KIR基因的檢出頻率普遍高于激活性KIR基因，這與健康人群中的特征一致。通過比較各個KIR基因在OBI獻血者與重慶漢族、河北漢族、江蘇漢族和我國健康人群中的頻率可以看出，KIR 2DL3在OBI獻血者中的分布頻率均低于上述人群，而與烏市維族和高加索健康人群一致。烏市維族和高加索健康人群均是HBV感染的低流行地區，這提示KIR 2DL3可能是HBV感染的保護性基因。 Gao等[17]研究發現KIR 2DL3-HLA-C1具有較強的保護作用，di Bona等[18]發現KIR 2DL3與其配體結合有助于HBV的自發清除，Zwolinska等[19]的研究顯示只有KIR 2DL2基因而沒有KIR 2DL3基因會讓HIV易感率増加4倍以上，這些結果與本研究結論相似。但KIR 2DL3保護機體免受病毒感染的具體作用機制尚未明確，推測可能與KIR 2DL3與相應配體結合后分泌更多的干擾素有關[20]。此外，有文獻[8]表明，KIR 2DS2、2DS3是HBV易感基因，能誘導持續較弱的炎癥反應。而KIR 2DS1、3DS1、2DL5可能是保護基因，可以促進HBV的清除。其他研究[21]也表明，KIR 2DS3基因頻率在梅毒、慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者中升高。本研究將OBI獻血者與文獻報道的HBV感染組作比較，KIR 2DS2、2DS3基因頻率降低，而KIR 2DS4、3DL1頻率升高，提示OBI獻血者低病毒載量可能與NK細胞KIR活化和抑制信號的平衡關系有關，也與KIR-配體間相互作用、種族、地域、病毒特征等有關，而不單純取決于KIR基因多態性。

表4 OBI獻血者與不同病種人群、不同地區健康人群的KIR基因型頻率的比較(%)

KIR 2DS4是攜帶頻率在90%以上的唯一活化性基因，也是單倍型A唯一的激活性KIR基因，提示這一基因在NK細胞的功能調控和疾病相關性中可能發揮重要作用。KIR 2DS4在第5外顯子缺失22 bp ，產生變異體KIR 1D編碼可溶性分子，編碼蛋白無法錨定在細胞膜上導致激活信號不能傳遞，因此KIR 1D可屏蔽KIR 2DS4或NK細胞上其他受體的配體或作為清除可溶性HLA的誘導物，干擾NK細胞功能[22]。 Zhuang等[23]研究結果顯示，中國漢族梅毒患者KIR1D 純合子的基因頻率較正常對照組顯著增高(16.9% vs 6.6%，χ2=4.596，P<0.05)，提示KIR 1D 純合子可能與中國漢族人群的梅毒易感性相關。在OBI獻血者中同樣觀察到攜帶有KIR 2DS4*del基因的頻率較重慶漢族健康人群升高(45.7 %vs 26.9%，χ2=12.911，P<0.05)，顯示出同梅毒人群中的易感性特征。但在普通的HBV感染人群中，Pan等[24]報道了101例慢性HBV感染患者中有26例攜帶有KIR 1D，明顯低于OBI獻血者的頻率(45.7% vs 25.7%，χ2=8.921，P<0.05)。因此，KIR 2DS4*del可能是HBV感染的一個易感基因，但也可能是OBI獻血者低病毒載量的一個有利因素，可能與病毒特征、配體特異性等相關，下一步本研究團隊將就此展開研究。

KIR的基因型由2條單倍體構成，本研究發現單倍體A在OBI組、強直性脊柱炎和健康對照組所占的比例均高于單倍體B，但這兩種單倍體在兩組之間不存在明顯的統計學差異，表明單倍體型分布情況在OBI中的致病作用關系不大。HLA-Ⅰ類基因是KIR的配體，兩者間的相互作用以及HLA和KIR作為人體多態性最豐富的基因系統，造成了某些特定基因人群可能無法清除低水平的HBV從而產生OBI。因此，探明KIR與HLA-Ⅰ類基因組合在OBI感染過程中的易感性和保護性作用，進一步多地區、大樣本及深層的免疫學研究，闡明NK細胞調節HBV感染的機制是非常必要的。