食管鱗狀細胞癌（ESCC）中PD-1/PD-L1/PD-L2的表達與臨床因素及預后的相關性

隋啟海 詹 成 馬 可△ 王 群

（1復旦大學上海醫學院2016級臨床醫學八年制 上海 200032；2復旦大學附屬中山醫院胸外科 上海 200032）

食管癌是全球十大最常見和最致命的腫瘤之一［1］。在中國，食管癌是與癌癥相關的第四大死因，而其中食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占食管癌的90%以上［2］。即使隨著診斷和治療的進展，ESCC患者的5年生存率仍然不甚理想［3］。

程序性細胞死亡受體1（programmed death-1，PD-1，NCBI Gene Name：PDCD1）基因由Ishida于1992年發 現［4］，PD-1受體有兩種天 然配體，PD-L1（PD ligand 1，PD-1，NCBI Gene Name：CD274）和PD-L2（PPD ligand 2，PD-L2，NCBI Gene Name：PDCD1LG2），三者之間相互作用抑制T細胞活化［5］。除免疫細胞外，三者還可以在多種腫瘤細胞中表達［6］，其在阻斷“癌癥免疫周期”中起著至關重要的作用［7］。但PD-1等在ESCC中的表達仍然有待明確，在本研究中，我們采用免疫組化的方法，對325例ESCC患者腫瘤組織及部分對應正常組織中PD-1、PD-L1、PD-L2的表達進行研究，以確定其臨床意義。

資料和方法

研究對象收集2007年1—12月在復旦大學附屬中山醫院胸外科接受手術治療的全部325例食管腫瘤患者的臨床基本信息和隨訪信息。臨床基本信息包括年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤組織學類型、腫瘤術后TNM分期、總分期（以UICC8版分期為參考）、腫瘤標本最大徑；臨床基本信息來源為我院留存病史。隨訪信息包括是否生存、死因、生存時間；信息均為出院后通過電話或門診的方式獲得，隨訪截止時間為術后72個月。詳細的臨床和病理數據見表1。本研究經復旦大學附屬中山醫院倫理審查委員會批準（倫理編號：B2017-233R）。

標本來源所有標本均取自患者術后石蠟包埋組織，取材后鏡下觀察，避開腫瘤壞死區域和炎癥區域。取材滿意后，將石蠟組織制成組織芯片，以供后續的免疫組化實驗。

免疫組化使用基因科技（上海）股份有限公司的GTVisionTMⅢ抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒檢測PD-1、PD-L1和PD-L2表達。組織切片首先在檸檬酸鈉抗原修復液中處理，脫蠟脫水后用山羊血清溶液（美國Thermo Fisher Scientific公司）封閉處理。然后采用針對PD-1（1∶200，86163），PD-L1（1∶200，13684）和PD-L2（1∶200，82723）（美國Cell Signaling Technology公司）的兔抗人單克隆抗體處理，將載玻片在4 ℃下避光孵育18 h。充分洗滌后用二抗處理組織切片1 h，洗滌后加DAB顯色液至覆蓋完全。充分顯色后終止并采用蘇木精復染，中性樹膠封片，鏡下觀察。

二位醫師獨立按免疫反應評分（immunoreactivity score，IRS）判別染色是否為陽性。IRS的計算方法為染色強度分數與陽性細胞比例分數的乘積［8］。其中染色強度的判斷標準為：無色0分，淡黃色1分，深黃色2分，黃褐色3分；該標準以著色細胞與著色背景相對比。陽性細胞比例的判斷標準為：0%為0分，1%～30% 為1分，31%～60% 為2分，61%～100%為3分。對于每例組織，IRS＜4分時判讀為免疫組化染色陰性，IRS≥4分時判讀為免疫組化染色陽性，PD-1、PD-L1、PD-L2染色均以此為標準［9］。

表1 PD-L1和PD-L2陽性表達比例與各臨床因素相關性Tab 1 Correlation between PD-L1 and PD-L2 positive expression ratio and clinical factors ［n（%）］

統計學分析采用配對檢驗分析腫瘤組織和癌旁組織中PD-1等表達差異。用χ2檢驗以及秩和檢驗分析PD-1等陽性表達與ESCC患者各臨床因素有無統計學關聯；用Kaplan-Meier生存曲線法分析PD-1、PD-L1、PD-L2一個或多個表達與ESCC患者的生存時間之間有無統計學關聯；配對檢驗、χ2檢驗、秩和檢驗用SPSS 25.0軟件，Kaplan-Meier生存曲線用R語言（版本號3.5.2，https：//www.r-project.org）進行，P＜0.05（雙尾）為差異有統計學意義。

結 果

PD-1、PD-L1、PD-L2在ESCC腫瘤組織及癌旁組織中的表達染色評分結果顯示，102對腫瘤與正常組織中，PD-1在正常組織中均未見表達，13例（12.8%）腫瘤組織中PD-1呈陽性；9例（8.8%）PDL1為陽性，57例（55.9%）檢測到PD-L1在癌組織中表達；21例（20.6%）癌旁組織PD-L2為陽性，34例（33.3%）腫瘤組織PD-L2呈陽性表達。

325例ESCC腫瘤組織中，有39例（12.0%）可見PD-1表達，171例（52.6%）PD-L1陽性，107例（32.9%）PD-L2陽性。PD-1（P＜0.001）、PD-L1（P＜0.001）、PD-L2（P=0.023）在癌旁組織和癌組織中的表達差異有統計學意義。

PD-1、PD-L1、PD-L2表達與各臨床因素分析全部325例病例各臨床因素與PD-1、PD-L1、PDL2陽性表達的相關性，納入分析的臨床因素包括年齡、性別、吸煙情況、腫瘤位置、腫瘤最大徑、淋巴結轉移（N分期）、T分期、術后分期等8項，由于M分期數據較少，因而未納入分析范疇。

根據統計分析及秩和檢驗結果，T分期越高，PD-L1、PD-L2的表達率越高，且不同分期組間兩者陽性比例有顯著差異。與不同T分期PD-L1的陽性表達比例（P＜0.001）比較，PD-L2（P＜0.001）在不同T分期間的差異更為顯著，但PD-1與之無關。

不同術后分期患者PD-L1、PD-L2的陽性表達率之間有顯著差異，總體上，術后分期越高的患者，兩者的陽性表達率越高。與不同術后分期的PDL1陽性表達比例比較（P=0.006），PD-L2（P=0.002）的差異性更為顯著，但PD-1與之無關。

PD-1、PD-L1的表達與患者年齡、性別、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結轉移、腫瘤位置之間均未見顯著性關聯（表1）。而PD-L2的表達與淋巴結轉移（P=0.044）相關。

PD-1、PD-L1、PD-L2單陽性表達對ESCC預后的影響在有隨訪記錄的239例樣本中，PD-1陽性表達的有32例（13.4%），中位生存時間為42個月；陰性的有207例（86.6%），中位生存時間為36個月。二者的KaPlan-Meier生存曲線如圖1A所示。PD-1表達陽性的患者與陰性患者相比，總生存率無顯著差異（P=0.500）。

239例樣本中，共有123例（51.5%）患者腫瘤組織中PD-L1呈陽性表達，中位生存時間為34個月；116例呈陰性（48.5%），中位生存時間為57個月；二者的生存曲線如圖1B所示，總生存率差異無統計學意義（P=0.058）.

239例樣本中，共81例（33.9%）腫瘤組織中PDL2表達為陽性，中位生存時間為33個月；158例呈陰性（66.1%），中位生存時間為41個月；二者的生存曲線如圖1C所示，總生存率差異無統計學意義（P=0.096）。

PD-1、PD-L1、PD-L2中多個陽性表達對ESCC預后的影響239例樣本中，82例（34.3%）腫瘤組織中無PD-1、PD-L1、PD-L2表達，92例（38.5%）腫瘤組織有PD-1、PD-L1、PD-L2中的一個陽性表達，65例（27.2%）腫瘤組織中有PD-1、PD-L1、PD-L2中的2～3個陽性表達，不同組間的總生存率差異有統計學意義（P=0.025），特別是無陽性表達組，其生存狀況明顯優于有陽性表達組，但單陽性表達組與多個陽性表達組間無明顯差異（圖2）。

討 論

PD-1、PD-L1、PD-L2在食管癌中的表達及意義PD-1是主要在活化T細胞上表達的陰性共刺激受體，可調節相關細胞的活化與凋亡［10］。PD-L1通常由響應免疫介導的IFNγ 等信號驅動，在腫瘤中活躍的T細胞炎癥區域中表達［11］，其在癌細胞和免疫細胞上的表達可以抑制T細胞抗腫瘤反應，從而允許腫瘤生長。PD-L2在某些B細胞淋巴瘤中高度上調［12］。對于PD-L2在腫瘤組織中的表達與預后的相關性及其與PD-1靶向治療反應相關性的研究并不多。PD-L2似乎在活化的CD4和CD8T細胞亞群上表達，PD-1與T細胞表面的PD-L2結合能夠下調細胞因子的產生，若在T細胞上直接靶向PD-L2可阻斷T細胞增殖［13］。

Leng等［14］報道其研究中46.2%的ESCC組織中PD-L1呈陽性，42.5%的ESCC組織中PD-L2呈陽性。在本研究中PD-L1在52.6%的ESCC中表達，PD-L2在32.9%的ESCC中表達，PD-L1的表達明顯高于PD-L2。與之相類似，Grosso等［15］觀察到ESCC中具有更高的PD-L1表達。

Leng等［14］發現PD-L1陽性患者的預后明顯差于陰性患者，而他們的預后與PD-L2表達無關，并報道PD-1+TILs（腫瘤浸潤淋巴細胞）的數量與PD-L1和PD-L2表達呈負相關。但是，在另一項研究中，食管癌中TILs和PD-L2的存在呈負相關，而PD-L1與TILs無明顯相關性。此外，有關于晚期食管癌患者的研究中，通過多變量分析發現PD-L1陽性表達是獨立的預后因素［9］。

本研究中PD-L1和PD-L2在不同T分期食管鱗癌患者中的陽性表達率差異有統計學意義（P＜0.05），并且PD-L2陽性表達差異率與不同T分期之間的關聯比相應PD-L1更為顯著，這與先前大部分研究結果相似。而且，PD-L2表達還與術后分期以及淋巴結轉移（N分期）顯著相關，這些結果提示ESCC的PD-1、PD-L1、PD-L2通路免疫治療中，針對腫瘤原發灶的標準應以腫瘤浸潤程度或T分期為準，而不應以腫瘤最大徑為標準。此外，PD-1、PD-L1和PD-L2在癌組織及癌旁組織中的表達差異有統計學意義，而腫瘤位置與PD-L2陽性表達差異率之間似乎有一定關聯，PD-L2陽性表達率隨腫瘤位置的深入而增大，但差異無統計學意義，未來可以進一步加大樣本量探討兩者之間是否確實有關聯。

目前認為PD-L1在細胞質中的過表達是食管癌切除術后ESCC患者無病生存期的獨立預后因素［16］。本研究通過Kaplan-Meier生存曲線分析證實，PD-1、PD-L1、PD-L2單個表達與食管癌患者存活時間之間無顯著相關性，但總體上，存活組PDL1、PD-L2的陽性表達率低于死亡組，并且PD-L1陽性表達組與陰性表達組間生存曲線的差異接近于顯著差異，未來需加大樣本量進一步檢驗PD-1、PD-L1、PD-L2表達與ESCC患者預后的關系。另一方面，本研究針對PD-1、PD-L1及PD-L2中多個陽性表達對ESCC預后的影響進行了評估。結果顯示，這三者任意兩個陽性表達或是全部呈陽性表達時，患者的預后較單表達組未出現統計學差異，但是其與無PD-1、PD-L1、PD-L2表達組間的生存曲線有明顯差異，表明這三者均未出現陽性表達的患者術后存活時間更長，相類似，Hsieh等［3］通過研究150例ESCC病例得出結論，PD-L1和PD-L2的 表達之間存在相關性，沒有過度表達PD-L1和PD-L2的患者似乎具有更好的總體存活率，但差異無統計學意義。這些結果提示，對于患者術后生存狀況的判斷，應將PD-1、PD-L1、PD-L2三者均納入考量范圍，三者共陰性與良好生存狀況相關程度更高，而非僅考慮PD-L1和PD-L2。

而除了ESCC，比較引人注目的是Derks等［17］發現在食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）中，51.7%的EAC癌細胞中有PD-L2表達，而上皮PD-L1僅在2%的病例中表達。這一發現可能會引發關于PD-1死亡信號通路的另一個研究方向，如PD-1/PD-L1通路在上皮細胞腫瘤中位于主導地位，而PD-1/PD-L2通路在腺癌中更為重要。

總之，目前主流觀點認為PD-L1的表達與ESCC的生存率相關，而PD-L2的表達與ESCC生存率的關聯性不如PD-L1顯著，PD-1與ESCC生存率無關聯，并且不同實驗結果差異性較大。總體上，PD-L1、PD-L2均未過表達的患者表現出更好的總體生存率［18］。這一點在本研究中也有明顯表現，其差異具有統計學意義，而其中相關機制還有待進一步的實驗證明。

PD-1、PD-L1、PD-L2通路相關藥物在ESCC中的研究進展目前，兩種抗PD1單克隆抗體納武單抗和帕姆單抗可用于多種類型癌癥的臨床治療［19］。

Ib期KEYNOTE-028試 驗，Ⅱ期KEYNOTE-059試驗和Ⅱ期KEYNOTE-180試驗研究了帕姆單抗在食管癌患者中的抗腫瘤活性和安全性。針對經過大量預處理的PD-L1陽性晚期食管癌患者（78%ESCC，22%EAC）的Ib期KEYNOTE-028試驗，帕姆單抗顯示出有希望的抗腫瘤活性（客觀緩解率：30%）和可控的安全性［20］。KEYNOTE-059研究納入了259例局部或晚期轉移性胃癌（49%）或胃食管交界腺癌（51%）患者［21］，其中，55%（n=143）的腫瘤表達PD-L1，客觀反映率為13.3%（95%CI：8.2～20.0），1.4%有完整回復［22］。在參加Ⅱ期KEYNOTE-180研究的121名接受過預治療的晚期轉移性ESCC或EGJ晚期Siewert 1型腺癌患者中，接受帕姆單抗治療的患者客觀反應率為9.9%［23］。Ⅲ期KEYNOTE-181（Clinical Trials.gov，NCT02564263）用于比較帕姆單抗單藥治療與紫杉醇、多西紫杉醇或伊立替康等標準療法治療晚期EAC或ESCC患者的療效，試驗結果表明，這一免疫療法使PD-L1聯合陽性分數（combined positive score，CPS）≥10的腫瘤患者總生存率有顯著的改善［24］。然而，一項包含592名胃食管癌患者的臨床Ⅲ期實驗［25］中表明，與紫杉醇相比，盡管帕姆單抗具有更好的安全性，但帕姆單抗作為PD-L1（CPS≥1）晚期胃食管連接癌的二線療法并未顯著改善總生存率。此外，目前，KEYNOTE-590試驗正在進行，該Ⅲ期臨床試驗旨在研究帕姆單抗作為晚期食管癌（包括晚期不可切除或轉移性腺癌、ESCC、食管胃交界的晚期Siewert 1型腺癌）一線治療的安全性和有效性，并驗證帕姆單抗與化療相結合是否可提供比單獨化療更明顯的效果［26］。

納武單抗是一種人單克隆IgG4抗體，Kudo等［27］證明納武單抗在治療難治性食管癌患者中有一定的活性以及可控的安全性。同樣，Kang等［28］關于納武單抗的Ⅲ期研究中顯示，無論PD-L1表達狀態如何，使用納武單抗組患者的總體生存效益優于安慰劑組。ATTRACTION-4研究中評估了納武單抗聯合S-1加奧沙利鉑（SOX）或卡培他濱加奧沙利鉑（CapeOX）作為不可切除晚期或復發人表皮生長因子受體2陰性胃/胃食管交界癌患者一線治療方法的安全性和有效性，結果證明，納武單抗加化療具有可控的安全性和抗腫瘤活性［29］。

目前，針對于PD-1通路的藥物均仍在臨床試驗階段，并且已有較為顯著的效果，但是其與傳統化療效果的差異性以及其與標準療法相結合的治療思路是否有更優的療效等還有待進一步考證，更大規模、更深入的試驗及研究可以為日后相關癌癥的治療提供新方向。