四川濃香型大曲生產中酵母菌、芽孢桿菌與 工藝指標的關聯性分析

向慧平，林宜錦，關統偉,，張家旭，尚紅光，趙小林，焦士蓉，馮 栩，楊 陽

（1.西華大學微生物研究所，四川省高校食品生物技術重點實驗室，四川 成都 610039；2.成都蜀之源酒業有限公司，四川 成都 611335）

中國白酒獨特的固態發酵技術已有數千年的歷史[1-2]， 而濃香型白酒以其香味諧調濃郁和口感綿甜醇厚的優良品質，占據了70%的中國白酒市場。曲為酒之骨，濃香型大曲是釀造優質濃香型白酒的關鍵，它屬于中高溫曲，55～60 ℃的頂溫[3]。常見的制曲工藝分為1 個月的曲房培菌期和3 個月的貯存期[4]。而在實際生產中，大曲的貯存期往往會被延長，部分大曲的貯存期甚至會被延長至1 年以上。目前，國內學者對大曲的研究已經由表及里深入到大曲的特征風味[5]、微生物類群演替及其功能表達[6-7]，并取得了許多成果，研究發現棲息于大曲中的微生物決定了大曲的品質，它們不僅參與白酒的發酵，還提供豐富的酶系（如糖化酶、纖維酶、淀粉酶和酯酶等）用于底物降解和風味化合物的生產，同時制曲過程中產生的代謝物進一步轉化為末端風味成分的中間體。

大曲中微生物菌系時刻在進行復雜的動態變化，其中豐度最高的微生物類群是霉菌，其次為酵母和細菌[8]。霉菌為大曲提供了主要的糖化動力，然而其多性遠低于酵母和細菌[9-11]。因，研究者對大曲霉菌類群投入了更多的關注，霉菌在大曲中起到的作用和影響逐漸被剖析，其中曲霉主要為曲酒的釀造提供糖化力、液化力、蛋白質分解能力及多種有機酸等物質[2]，以米根霉為主的根霉可產生較多的胞外酶和胞內酶[12]，毛霉生成的分解蛋白質酶系對曲酒發酵至關重要[2,13]，而青霉、犁頭霉基本屬于有害菌[2]。雖然酵母菌為大曲提供了主要的發酵動力，細菌為大曲提供了主要的生香動力[9]，但是與霉菌相比，目前對大曲酵母和細菌類群的研究仍然不夠深入。

酵母作為大曲微生物區系中最重要的類群之一，不僅主導了乙醇的產生，而且大量產生酯類、醇類、酮類、烯類、酚類等揮發性化合物[14-15]，對大曲品質有決定性的影響。譚崇堯等[16]使用高通量測序法對不同地域濃香型大曲的微生物結構進行了分析，結果表明川派濃香型大曲中芽孢桿菌屬的豐度遠高于其他地區。另外，一些研究發現芽孢桿菌不僅能夠產生大量揮發性化合物和有機酸影響大曲的微生物菌系和風味[17-18]，而且還具有顯著改善中國白酒的品質、安全性和風味的潛力[19-20]。因，本研究通過純培養分離技術監測四川濃香型大曲整個制曲過程中酵母菌、芽孢桿菌的動態演化以及相應的動態工藝指標，科學分析它們之間的關聯特性，為優質大曲的釀造和大曲自動化制備及其改良提供科學依據。同時，明確大曲的成熟期與品質下降期，從而更好地指導釀酒生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP和DL2000 Marker 寶生物工程（大連）有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；實驗涉及的所有緩沖液與常備試劑均為國產分析純試劑，購于成都迪維普科技有限公司。

1.2 儀器與設備

P C R 儀、電泳儀及凝膠成像分析系統 美國 Bio-Rad公司；離心機 德國Eppendorf公司；恒溫培養箱、SPX-150B-Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司；搖床、超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌和芽孢桿菌的分離

準確稱取不同階段的大曲粉末1 g，加入100 mL無菌水，置于搖床上150 r/min、30 min，靜置，取其上清液進行系列10 倍梯度稀釋。首先采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose agar，YEPD）培養基對酵母菌進行選擇性分離，形態觀察用Wallerstein Laboratory（WL）培養基。其次是芽孢桿菌的分離，將不同濃度的稀釋液分別接種到富集培養基中進行富集（37 ℃、 150 r/min培養24 h），隨后對培養液進行菌體殺滅和富集芽孢（90 ℃，5 min），在LB培養基、乙酸鈉培養基和蘇氨酸液體發酵培養基上進行平板分離。

1.3.2 菌株的初步鑒定

將分離的所有菌株經過初步形態聚類，選取代表菌株用十六烷基三甲基溴化銨法提取菌株DNA[21-22]，采用通用保守引物ITS1和ITS4對酵母菌株的5.8S rDNA-ITS區進行基因擴增，采用通用保守引物27f和1541r擴增芽孢桿菌的16S rRNA基因片段。擴增產物送上海生物工程技術服務有限公司（Sangon）純化并測序，將所測得的序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，結合形態學分析和序列比對對菌株進行排重和初步鑒定。

1.3.3 工藝指標檢測

使用溫度計測量曲堆中心溫度；制曲理化因子（水分、酸度、淀粉含量）和大曲質量指標（糖化力、液化力、發酵力、酯化力）的測定按照QB/T 4257ü 2011《釀酒大曲通用分析方法》[23]進行。

1.3.4 相關性分析

2 結果與分析

2.1 可培養酵母菌和芽孢桿菌的分離與動態變化

表 1 11 個樣品中酵母菌和芽孢桿菌典型菌株的分離情況統計Table 1 Typical species of the culturable yeast and Bacillus detected in 11 samples

2.2 大曲理化指標變化

表 2 濃香型大曲發酵過程中理化指標的動態變化Table 2 Dynamic changes in physicochemical indexes during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu

濃香型大曲生產過程中最重要的控制條件是堆芯溫度、水分和酸度，實際生產中通常用這3 個條件控制曲房培菌期的生產狀況；外，淀粉也揭示了大曲生產過程中主要的能量代謝情況。如表2所示，曲塊堆芯溫度在培菌期前3 d快速增加至49 ℃，并在第9天升到最高溫度60 ℃，達到中高溫大曲的頂溫范圍，隨后堆芯溫度緩慢降低，直至第15天仍有55 ℃。水分是大曲生產過程中另一個關鍵點，在培菌期前15 d快速降低至16.27%，損失了17.55%的水分，而在之后的15 d損失了3.01%的水分，培菌期結束時僅為13.26%；在貯存期水分略有降低，但是變化不顯著。大曲的酸度在培菌期前3 d由0.16 mmol/10 g快速增加至1.77 mmol/10 g，酸度升高主要是由產酸微生物在大曲中進行有機酸代謝，酸度在第15天快速下降至0.96 mmol/10 g；而在培菌期穩定在1 mmol/10 g左右。淀粉作為最主要的碳源，其變化趨勢直接表征了大曲生產過程中微生物的能量代謝狀況。11.39%的淀粉在發酵前15 d被利用，2.70%的淀粉在發酵后15 d被利用，而整個貯存期則有9.10%的淀粉被利用。

2.3 大曲質量指標的變化

白酒釀造過程通常用糖化力和液化力衡量大曲的淀粉轉化能力，用發酵力和酯化力作為評估大曲產酒產香能力的關鍵指標。液化力與糖化力變化趨勢大致一致（圖1），都在培菌前期快速增加后小幅下降，接著在培菌中后期又逐漸回升，而在貯存期總體上呈下降趨勢。液化力在第9天達到最大值2.17 g/（gg h），第9～15天逐漸下降至1.09 g/（g?h），在培菌中后期又逐漸上升至1.27 g/（g?h），而在貯存期，液化力一直下降，結束時僅剩0.72 g/（g?h）。糖化力在前9 d快速增加至447.22 mg/（gg h），接著緩慢下降至 425.76 mg/（gg h）（第15天），隨后緩慢增加至貯存期第180天的477.61 mg/（gg h），而在貯存期的第181～360天，大曲損失了180.84 mg/（gg h）的糖化力。發酵力反映了大曲發酵產乙醇的能力，酯化力反映了大曲微生物生產酯類物質的能力，如圖2所示，培菌期前9 d酯化力和發酵力快速升高，培菌期第0天品的酯化力和發酵力分別為31.52 mg/（50 gg 7 d）和 0.2 8 g/（0.5 g g 7 2 h），第9 天分別升高至 738.58 mg/（50 gg 7 d）和1.02 g/（0.5 gg 72 h）。隨后酯化力持續增加，在貯存期第9 0 天時高達 944.57 mg/（50 gg 7 d），而在貯存期的第181～360天，酯化力快速下降至475.66 mg/（50 gg 7 d）。不同的是，發酵力在培菌期第9～15天快速下降后又緩慢回升，培菌期結束時逐漸穩定在1.13 g/（0.5 gg 72 h），發酵力在貯存期呈緩慢降低的趨勢，貯存期結束時為 0.69 g/（0.5 gg 72 h）。同在整個貯存期的第90～180天，4 個質量指標都趨于穩定并處于較高水平，而在貯存期的第180～360天卻大幅下降，綜合考慮，本研究所用大曲在生產周期第90天后品質達到穩定成熟；生產周期第90～180天為大曲最佳使用期。

圖 1 濃香型大曲生產過程中糖化力、液化力的動態變化Fig. 1 Dynamic changes in saccharifying power and liquefying power during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu

圖 2 濃香型大曲生產過程中酯化力、發酵力的動態變化Fig. 2 Dynamic changes in esterifying power and fermenting power during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu

2.4 濃香型大曲生產中工藝指標與酵母菌和芽孢桿菌類群的關聯性分析

制曲工藝通過溫度、水分和酸度的調控，篩選和富集了大量有益微生物。微生物的演替和代謝最大化積累了各種功能酶和風味物質，同時通過曲房貯存平衡微生物菌系提高大曲品質。因，了解大曲中起主要作用的酵母菌和芽孢桿菌與關鍵指標的關聯性極其重要。RDA（圖3）展示，堆芯溫度、水分和淀粉含量與多種微生物類群負相關，其中與B. velezensis、 C. parapsilosis、J. angkorensis、K. marxianus和 S. cerevisiae呈現顯著的負相關（P＜0.05）。酸度與B. siamensis、B. licheniformis和B. cereus顯著正相關 （P＜0.05），表明這3 株芽孢桿菌可能具有良好的產酸或耐酸能力。4 個質量指標之間本身具有較強的正相關，其中B. horneckiae和B. subtilis與液化力具有顯著的正相關（P＜0.05）；K. exigua和C. tropicalis與酯化力、糖化力具有顯著的正相關（P＜0.05）； W. anomalus和B. megaterium與發酵力具有顯著的正相關（P＜0.05），表明這6 株菌是潛在的功能菌，對大曲的品質起著重要影響。

圖 3 大曲生產中工藝指標與酵母菌和芽孢桿菌類群的關聯性分析Fig. 3 Correlation analysis of the communities of yeast and Bacillus with process parameters during the fermentation of Luzhou-flavor Daqu

3 討 論

目前，對于濃香型大曲的工藝參數[25]、微生物菌系演替及其功能作用[26-27]等已經有一些研究，但是學者們往往聚焦于曲房培菌期，而對于濃香型大曲成熟期、貯存期的微生物、酶學及其工藝參數指標研究的相對較少，且不系統。本研究旨在多度系統分析四川濃香型大曲整個生產周期中酵母菌和芽孢桿菌多性變化，并結合理化指標和質量指標，探索濃香型大曲關鍵性微生物類群中的酵母菌和芽孢桿菌在大曲品質形成中的作用。本研究發現四川濃香型大曲在第90～180天期間品質穩定成熟，是釀酒最好的使用期。成熟后的大曲糖化力、液化力、酯化力和發酵力都達到行業標準，其中第90天時發酵力高達1.15 g/（0.5 g?72 h），而宋瑞濱等[28]研究的優質中高溫大曲的發酵力僅為0.58 g/（g?72 h）；同時酯化力在第90天時最高為944.57 mg/（50 g?7 d），也遠超行業標準的最低酯化力150 mg/（50 g?7 d）。大曲在第180天后質量開始劇烈下降，其中糖化力與酯化力下降幅度最大；如果以第90天為優質大曲，那么貯存期結束時已經損失了相當于優質大曲36.89%的糖化力和49.64%的酯化力。因，貯存6 個月后的大曲由于品質的下降，應加強貯存方法的改進，延長其高品質期；同時，在未來釀酒過程中應加強與新成熟大曲的混用，彌補其不足。當然，由于貯存條件、制曲工藝和區域生態環境的差異，應實時檢測大曲質量，更好地指導釀酒生產。

本研究表明四川濃香型大曲具有豐富的可培養酵母菌和芽孢桿菌多性，共分離到9 個屬的酵母菌以及8 個種的芽孢桿菌。與以往研究相比[26-27]，首次在濃香型大曲中分得J. angkorensis和B. velezensis。外，Yang Jiangang等[29]同對濃香型大曲生產過程中的微生物類群進行選擇性分離，發現成曲中細菌以枯草芽孢桿菌亞種為優勢菌，酵母類群以扣囊復膜孢酵母（S. fibuligera）為優勢菌。在本研究中枯草芽孢桿菌同為優勢菌，而扣囊復膜孢酵母并未分離得到，我國白酒制曲是開放式自然制曲，存在大曲的品質與微生物群落的不穩定性，進而影響白酒的品質與穩定性。

RDA結合工藝指標對大曲酵母菌和芽孢桿菌類群類群演化進行關聯性分析，發現了6 種關鍵微生物類群，分別是3 種酵母菌（K. exigua、C. tropicalis和 W. anomalus）和3 種芽孢桿菌（B. horneckiae、B. subtilis和B. megaterium），它們分別與4 個質量指標顯著正相關，這將為未來開發純種制曲提供科學依據。外， B. cereus、B. licheniformis和B. siamensis與酸度顯著相關，有研究表明B. cereus和B. licheniformis是白酒生產中的重要產酸菌[17-18]，則大曲生產過程中嚴格控制酸度有助于調控和平衡大曲中的微生物組成與數量，同時產生的有機酸還將與醇類化合物反應產生濃郁的白酒風味化合物[30-32]。關聯性分析發現4 個質量指標與堆芯溫度都沒有顯著相關關系，而Xiao Chen等[33]研究發現以堆芯溫度為代表的生物熱是影響中高溫大曲微生物群落結構的關鍵環境因子，則制曲過程中溫度對大曲品質調控可能更多的是間接作用，因在濃香型大曲生產工藝優化時應更全面了解這種間接作用。

本研究在分析大曲生產過程中酵母菌和芽孢桿菌類群演替的基礎上，結合工藝指標檢測，揭示了大曲生產過程中酵母菌和芽孢桿菌類群受理化因子的調控作用以及對大曲品質的影響，這將為大曲生產工藝中控溫、控水、排酸，優質大曲的釀造和大曲自動化制備與改良提供很好的科學參考。然而大曲微生物類群是一個完整的共生體，酵母菌和芽孢桿菌發揮作用離不開其他微生物的存在。本研究直接將酵母菌和芽孢桿菌從大曲微生物菌系中剝離出來，不考慮與其他微生物類群的相互作用，如霉菌、醋酸菌、乳酸菌和放線菌等，是對大曲微生物類群調控和功能作用的淺層研究。采用更全面的微生物多性分析技術，研究大曲生產過程中微生物類群受理化因子的調控作用以及對大曲品質的影響，將是未來更好地理解大曲發酵原理的新思路。