VEGF siRNA 聯合涼血通絡方治療脈絡膜新生血管的實驗研究

王維琦 ，彭華，馬珊，楊金潤，張昆，代自超，楊榮強，陳蕊，方雨葳

脈絡膜新生血管 (choroidal neovascularization，CNV)經常發生在眼底黃斑區，是多種眼部疾病如年齡相關性黃斑變性、特發性CNV、高度近視脈絡膜黃斑出血等眼底病共有的病理改變，可導致患者嚴重和不可逆的視力損傷[1-4]。CNV 發病機制十分復雜，尚未闡明。目前認為，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 是引起CNV 的重要因素之一，組織過度釋放的VEGF 參與CNV 發生、發展過程，因此抗血管內皮生長因子成為目前抑制CNV 的研究重點。通過玻璃體腔注射帶有目的基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）可高效、特異性地抑制CNV 中的VEGF 表達[5-6]。但CNV中有多因素致病、多因子參與，以抑制單一因子為目標的治療手段，難以達到滿意效果。目前越來越多的研究者嘗試各種療法的有機結合，使療效得到鞏固和提高。涼血通絡方為復方光明膠囊組方加減化裁而來，具有活血化瘀，軟堅散結，通絡明目等多種功效，在臨床上治療CNV 類眼病取得良好的效果[7]。本研究旨在研究涼血通絡方聯合VEGF siRNA治療CNV 類眼病的效果并探討其作用機制，為治療CNV 類眼病提供一種新的手段和科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物

健康8～10 周清潔級棕色BN 大鼠90 只（購于北京維通利華實驗動物技術公司），雌雄不限，體重180～220 g。實驗前裂隙燈檢查雙眼前節和眼底檢查均正常。動物及實驗適用條約符合國家科學技術委員會發布的《實驗動物管理條例》。動物合格證書編號為：SCXK（京）2011-0011

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器 氪激光機（美國Coherent 公司）、眼底血管造影儀（德國海德堡公司）、PCR 儀（德國Thermal）、切片機（美國Leica 公司）。

1.2.2 主要試劑 復方托吡卡胺滴眼液(北京雙鶴現代醫藥技術有限責任公司，4%鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥株式會社)，熒光素鈉注射液(Alcon Laboratories，Inc.美國)；兔源性VEGF 多克隆抗體(Proteintech)；兔 源 性PEDF多克隆抗體(Abcam)；HRP標記的羊抗兔多克隆抗體（Abmart）；RNAiso plus Total RNA 提取試劑（寶生物工程大連有限公司），Takara 逆轉錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司），HR EvaGreen qPCR Master Mix 試劑盒（上海輝睿生物科技有限公司）。

1.3 藥物

涼血通絡方由龍血竭、滇重樓、土鱉蟲、雞血藤、密蒙花、紫草、川芎等組成，參考《藥理實驗方法學》[8]，用量與濃度按有色鼠與人用藥量比進行換算（MechRubner 公式），配制臨床等效劑量濃度1.0 g/L生藥，由云南省中醫醫院制劑中心加工成水提液，袋裝密封備用。

siRNA 由廣州銳博生物科技有限公司設計并合成。根據基因庫中大鼠VEGF 基因的三段mRNA 序列設計化學合成3 對VEGFsiRNA：GCGGATCAAACCTCACCAA、GCCAGCACATAGGAGAGAT、GCCTGGTATGAGGACCTGC。

1.4 方法

1.4.1 CNV 動物模型的建立BN 大鼠，腹腔內注射10%水合氯醛（0.1 ml/100 g）麻醉后，右眼滴復方托吡卡胺滴眼液散瞳10 min，鹽酸奧布卡因表面麻醉，應用激光光凝儀在裂隙燈顯微鏡下，距視盤2 PD 位置圍繞視盤在2 支視網膜血管之間光凝1 個點，每眼共光凝8 個點。光凝參數為：波長532 nm，激光功率250 mW，光凝斑直徑50 μm，光凝時間0.05 s。光凝成功的判斷：有氣泡擴大并回縮，提示Bruch’s 膜被擊破。

1.4.2 分組90 只BN 大鼠，隨機分為3 組：空白對照組、VEGF siRNA 組、聯合治療組。各組動物按前述方法右眼激光光凝建立CNV 模型。

1.4.3 給藥方法 空白對照組：光凝后不予任何處理；VEGF siRNA 組：從光凝后第1 d 開始至光凝后13 d，每隔1 d 給予VEGF siRNA 5 μl（0.3 nmol/ul）玻璃體腔內注射，方法：大鼠角鞏緣后1 mm 處垂直球心進針,至玻腔內可以見到針頭時停，推注5 μl 藥物進入玻璃體腔內。保持注射器針頭于玻璃體腔內10s防止回流，緩慢拔除針頭，注射結束。聯合治療組：從光凝后第1 d 開始至光凝后13 d，每隔1 d 給予VEGF siRNA 5 μl（0.3 nmol/ul ）玻璃體腔內注射；同時給予涼血通絡方中藥灌胃，每只2 ml，每日1 次。

1.5 觀察指標

1.5.1 眼底熒光素血管造影（FFA）檢查 于光凝后14 d，隨機選取各組大鼠10 只，行眼底熒光素血管造影檢查，腹腔注射10%的水合氯醛（1 ml/100 g)麻醉，腹腔注射10%熒光素鈉注射液（0.1 ml/100 g），注射完成立即采用眼底照相機進行同步動態造影觀察照相。

1.5.2 組織病理學 光凝后14 d，各組在完成FFA 檢查后6 h，待大鼠體內熒光素染料排凈，經過量麻醉處死，立即摘除眼球，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，室溫過夜。常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，行4 μm連續切片并常規HE 染色。取連續切片中CNV 區域內視網膜至色素上皮層最大距離為CNV 中央厚度。

1.5.3 蛋白印記檢測 觀察脈絡膜VEGF、色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）蛋白表達。光凝后14 d，各組隨機選取10 只BN 大鼠，顯微鏡下去除眼前節，剝離去除視網膜組織，迅速置于蛋白裂解液中提取蛋白，-80℃保存。將50 μg的蛋白樣品加樣到配置好的SDS-PAGE 凝膠蛋白電泳，電泳后轉到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h；TBS 液漂洗；加入VEGF 抗體（1:1000）、PEDF 抗體（1:1500）、β-actin 抗體（1:5000），4℃過夜，TBS 液漂洗，HRP 標記的羊抗兔多克隆抗體（1:5000）室溫孵育1 h，TBS 液漂洗，曝光顯色。應用圖像分析軟件Image J 分析蛋白表達情況。

1.5.4 實時熒光定量PCR 檢測 觀察脈絡膜VEGF及PEDF mRNA 表達水平。光凝后14 d，各組隨機選取10 只BN 大鼠，顯微鏡下去除眼前節，將視網膜剝離去除，獲取脈絡膜-鞏膜復合體標本。利用RNAiso plus Total RNA 提取試劑提取RNA，Takara逆轉錄試劑盒反轉為cDNA，采用QuantStudio 3 型實時熒光定量PCR 檢測系統進行實時定量PCR，HR EvaGreen qPCR Master Mix 試劑盒，按照說明書使用。引物序列：VEGF（上游：TATCTTCAAGCCGTCCTGTG；下游：TTGACCCTTTCCCTTTCCTC）；PEDF（上游：CCGAGAACTGAAGACTATCC；下游：GTGTCCCTCAGAACAAAGA），以GAPDH 為內參。

1.6 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行統計分析，計量資料結果采用均數±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間的兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組熒光素滲漏面積比較

圖1 光凝后14 d 各組FFA 檢查熒光素滲漏情況。1A 空白對照組；1B VEGF siRNA 組；1C 聯 合 用藥組；1D 各組FFA熒光素滲漏面積比較條圖。* 與空白對照組比較，P＜0.05；△與VEGF siRNA組比較，P＜0.05

光凝后14 d，空白對照組可見較大的熒光素滲漏面積，而VEGF siRNA 組及聯合組熒光素滲漏面積較小，與空白對照組比較差異具有統計學意義(VEGF siRNA 組t=2.627,P=0.014，聯合用藥組t=5.361,P=0.000)，且聯合治療組熒光素滲漏面積小于VEGF siRNA 組，差異具有統計學意義(t=2.733,P=0.011)（圖1）。

2.2 各組CNV 中央厚度比較

光凝后14 d，空白對照組CNV 中央厚度較厚，VEGF siRNA 組及聯合用藥組CNV 中央厚度較薄，VEGF siRNA 組與空白對照組CNV 中央厚度比較差異具有統計學意義(t=2.312,P=0.013)，聯合用藥組與空白對照組CNV 中央厚度比較差異具有統計學意義(t=5.147,P=0.000)，且聯合用藥組CNV 中央厚度低于VEGFsiRNA 組，差異具有統計學意義（t=2.372,P=0.020），與FFA 檢查趨勢一致（圖2）。

2.3 脈絡膜VEGF 蛋白及PEDF 蛋白表達變化

光凝后14 d，VEGF siRNA 組、聯合用藥組VEGF 蛋白表達較空白對照組表達下調，差異均有統計學意義(VEGF siRNA 組t=2.495,P=0.019，聯合用藥組t=5.242,P=0.000)，聯合用藥組VEGF 蛋白表達低于VEGF siRNA 組，差異有統計學意義(t=2.747,P=0.011)。光凝后14 d，VEGF siRNA 組PEDF 表達程度與空白對照組比較無明顯差異(t=-1.847,P=0.076)，聯合用藥組PEDF 蛋白表達程度較空白對照組增強，差異有統計學差異(t=-11.11,P=0.000)（圖3A、3B）。

2.4 脈絡膜VEGFmRNA 及PEDFmRNA的表達變化

光凝后14 d，VEGF siRNA組、聯合用藥組VEGF 蛋白表達較空白對照組表達下調，差異均有統計學意義(VEGF siRNA 組t=2.795,P=0.009，聯合用藥組t=5.934,P=0.000)，聯合用藥組VEGF mRNA表達低于VEGF siRNA 組，差異有統計學意義(t=3.139,P=0.004)。光凝后14 d，VEGF siRNA 組PEDF mRNA表達程度與對空白照組比較無明顯差異(t=0.015,P=0.998)，聯合用藥組PEDF mRNA 表達程度較空白對照組增強，差異有統計學意義(t=-17.263,P=0.000)，與蛋白印記檢測趨勢一致（圖3C）。

3 討論

VEGF 是血管新生的主要誘導因子,其表達上調能促進血管內皮細胞增殖、分裂、遷移及基底膜和細胞外基質的降解,增加血管的通透性,在CNV 發病過程中有十分重要的作用[9-10]，因此抑制VEGF 表達成為治療CNV 重要靶點之一[11]。

siRNA 是一種有效的基因干擾策略，siRNA 的早期干預可能通過影響VEGF 的表達而抑制CNV的生長[5]。本研究采用激光光凝建立大鼠CNV 模型，于光凝后第1 d 開始至第13 d，每隔1 d 給予VEGF siRNA 玻璃體腔內注射，至第14 d，經FFA 檢查及HE 染色觀察，結果顯示RNA 干擾組眼底熒光素滲漏面積及CNV 中央最大厚度均較空白對照組減小，VEGF 蛋白表達及mRNA 水平均較空白對照組降低，提示VEGF siRNA 對CNV 有明顯的抑制作用，與文獻報道一致[12]。

圖2 光凝后14 d 各組CNV 光鏡圖片(HE×200)。2A 空白對照組；2B VEGFsiRNA 組；2C 聯合用藥組；2D 光凝后14 d 各組CNV厚度比較條圖。*與空白對照組比較，P＜0.05；△與VEGF siRNA 組比較，P＜0.05

圖3 各組脈絡膜VEGF、PEDF 蛋白電泳圖及表達量比較。3A 光凝后14 d 各組脈絡膜VEGF、PEDF 蛋白電泳圖，1 空白對照組；2干擾組；3 聯合用藥組；3B 光凝后14 d 各組脈絡膜VEGF、PEDF 蛋白相對表達量比較；3C 光凝后14 d VEGF、PEDF mRNA相對表達量比較。*與空白對照組比較，P＜0.05；△與VEGFsiRNA 組比較，P＜0.05

由于體內核酸酶的存在，siRNA 在細胞內迅速被降解，只能短暫的抑制新生血管進程從而導致新生血管復發，需反復注射。隨著玻璃體腔內注射的次數增加，可能會導致眼內感染、眼壓升高、青光眼、視網膜脫離等諸多并發癥。基因轉染雖然可提高抑制效果，但病毒的免疫原性和潛在突變的危險性限制了其臨床應用[13]。目前CNV 類眼底病病機尚未十分明確，針對單分子來控制血管新生的治療手段雖然顯示出一定抑制作用，不能從根本上解決CNV 的發生及其復發問題。而多種療法的有機結合，可協同產生更有效的阻止血管滲漏和抑制新生血管的形成的作用。

涼血通絡方為復方光明膠囊組方加減化裁而來，組方中含龍血竭、滇重樓、雞血藤等云南道地藥材：龍血竭性溫平，味甘咸，入心肝腎三經，具有活血化瘀，驅腐生肌、止血斂瘡、軟堅散結等作用，被譽為“活血圣藥”，具有雙向調控作用，為君藥；土鱉蟲性咸寒，有小毒，入肝腎經，具有破血逐瘀，通經止痛功效；滇重樓性微寒，味苦，歸肝經，清熱解毒，與土鱉蟲共為臣藥，加強破血逐瘀之效；雞血藤苦甘溫，歸肝腎經，功用補血，化瘀，通絡，被稱為“血分之圣藥”；密蒙花味甘，性微寒，歸肝膽經，清熱養肝，明目退翳；紫草性寒，味甘咸，歸心肝經，功效涼血活血，與雞血藤、密蒙花共為佐藥；川芎性辛溫，歸肝膽、心包經，功用行氣開郁化瘀，被譽為“血中之氣藥”，為使藥。全方共奏涼血化瘀，軟堅散結，退血翳通絡明目功效，在臨床上治療CNV 類眼病取得良好的效果[7]。

本文研究結果顯示，在行玻璃體腔注射VEGF siRNA 治療的基礎上，再加用涼血通絡方能有效減小眼底熒光滲漏面積、CNV 厚度，能有效抑制脈絡膜新生血管生長，療效高于RNA 干擾組。進一步研究顯示，兩者聯合應用，不僅可以降低VEGF 蛋白表達及VEGF mRNA 水平，還可增加PEDF 的蛋白表達及mRNA 水平。PEDF 屬絲氨酸蛋白酶抑制因子，是已知的最強的內源性血管抑制因子，可通過促進活化的血管內皮細胞凋亡從而引起新生血管的退化，抑制新生血管形成，PEDF 也可通過調節其他因子如VEGF、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor,FGF）的表達抑制血管增生[14]。

西醫治療有其不足，而中醫學博大精深，辨病與辨證相結合，內外兼治，從絡脈理論認識其病因病機，以絡脈“熱、瘀”立論，行涼血通絡治療，與RNA干擾技術聯合應用，2 種療法的有機結合，通過多個治療靶點共同作用，有可能彌補單一療法的不足，使療效得到鞏固和提高。

綜上所述，VEGF siRNA 干擾聯合涼血通絡方應用對于激光誘導的CNV 有明顯抑制作用，能更有效的阻止血管滲漏和抑制新生血管的形成的作用，為CNV 的治療提供了新思路。