加減膈下逐瘀湯對氣滯血瘀型慢性輸卵管炎模型大鼠ICAM-1、NF-κB 表達影響

鄭 躍，劉 麗，劉建秋

（黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040）

慢性輸卵管炎作為婦科的一類常見疾病，常可導致輸卵管肥大、積膿及積水等癥狀，并為導致女性不孕的關鍵因素。由于現代藥物流產以及人工流產事件的增加，由輸卵管原因所導致的不孕癥亦呈上升趨勢。本研究通過建立大鼠氣滯血瘀型慢性輸卵管炎模型，探究膈下逐瘀湯對模型大鼠輸卵管中炎性因子ICAM-1、NF-κB 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8～12 周的SPF 級雌性SD 大鼠，體質量（200±20）g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK（黑）2015-004。飼養溫度22 ℃，相對濕度40%左右。

1.2 實驗藥品與試劑 水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批號160209）、烏拉坦（上海山浦化工有限公司，批號151220），ICAM-1、NF-κB 一抗購自北京博奧森生物技術有限公司。水合氯醛、烏拉坦（上海山浦化工有限公司）、金黃色葡萄球菌（菌號ATCC29213，北京東方賽瑞生物技術有限公司），總RNA 提取試劑Trizol，BCA 蛋白試劑盒，試劑盒及ICAM-1、NF-κB 蛋白試劑盒（大連寶生物有限公司）。膈下逐瘀湯（GD）方藥組成：赤芍20 g，牡丹皮15 g，桃仁15 g，川芎15 g，枳殼15 g，延胡索20 g，香附20 g，烏藥15 g，地龍15 g，鱉甲15 g。（由黑龍江中醫藥大學中草藥房提供）。康婦炎膠囊（山東步長神州制藥有限公司，150530，服用方法：3 粒/次，2 次/d）。

1.3 分組與構建模型 雌性SD 大鼠，52 只，隨機分為4 組，分別為空白組（K）、模型組（M）、對照組（D）、膈下逐瘀湯組（G），每組 13 只。K 組不予任何處置，其余3 組在實驗第1 天以10%水合氯醛（0.04 mL/kg）腹腔注射麻醉實驗大鼠，后將實驗大鼠側臥式平放，常規剃毛、消毒，取肋緣過腎區0.5 cm 近脊柱側旁開1 cm 長的橫切口，打開腹腔，暴露一側卵巢、輸卵管及部分子宮，向輸卵管方向注入配置好的4×109/mL 金黃色葡萄球菌懸液0.1 mL，后逐層縫合腹壁，并消毒切口，另一側輸卵管操作方法同前。在第8 天時，給予D、G 2 組模型大鼠不可預知的慢性長期刺激，包括大鼠足底每8～15 min 1 次并持續10～12 h 的電擊刺激、噪聲刺激、閃爍光刺激，夾尾4 min/次，8 次/d，45°傾斜鼠籠1 次/d，2 h/次，連續21 d，構建氣滯血瘀模型[1-2]。

1.4 實驗給藥 在實驗第29 天時，G 組于每日上午9時，對實驗大鼠給予膈下逐瘀加減方（5.940 g/kg）灌胃1 次，同時D 組給予康婦炎膠囊（0.0648 g/kg）灌胃1 次，M 組用等體積純凈水代替，連續28 d。

1.5 樣品的采集及檢測 實驗大鼠在第28 天給藥后禁食不禁水12 h，常規消毒、備皮，以20%烏拉坦（10 mL/kg）腹腔麻醉，在無菌條件下解剖大鼠，取雙側輸卵管，放入預先處理好的凍存管中，液氮速凍，右側用于Real-time PCR 檢測ICAM-1、NF-κB mRNA 表達，左側用于Western Blot 檢測ICAM-1、NF-κB 蛋白表達。

1.6 統計學方法 Real-time PCR 結果采用MX-3000P軟件來分析各檢測樣本的Ct 值，Western-blot 結果使用NIH 的image J 軟件掃描分析，數據轉換到excel 上，以目的蛋白條帶的灰度值與內參照β-actin 條帶灰度值的比值來表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 引物信息 見表1。

表1 引物信息

2.2 氣滯血瘀型慢性輸卵管炎模型大鼠ICAM-1、NF-κB mRNA 表達 與空白組相比，模型組ICAM-1、NF-κB mRNA 表達升高顯著（P＜0.01），提示大鼠慢性輸卵管炎（氣滯血瘀型）模型構建成功；與模型組比較，膈下逐瘀湯組ICAM-1、NF-κB mRNA 表達極顯著下降（P＜0.01），可見膈下逐瘀湯對ICAM-1、NF-κB mRNA 表達有調控作用。見圖1～圖4。

圖1 ICAM-1 溶解曲線

圖2 ICAM-1 mRNA 表達

圖3 NF-κB 溶解曲線

圖4 NF-κB mRNA 表達

2.3 氣滯血瘀型慢性輸卵管炎模型大鼠ICAM-1、NF-κB蛋白表達 與空白組比較，模型組ICAM-1、NF-κB 蛋白表達升高（P＜0.01），提示ICAM-1、NF-κB 細胞因子發生了改變；與模型組比較，膈下逐瘀湯組可顯著降低ICAM-1、NF-κB 蛋白表達水平（P＜0.01），提示膈下逐瘀湯對氣滯血瘀型慢性輸卵管炎有治療作用。見圖5。

圖5 氣滯血瘀型慢性輸卵管炎模型大鼠ICAM-1、NF-κB蛋白表達

3 討論

膈下逐瘀湯方中牡丹皮具有活血化瘀，清熱涼血之功效；烏藥、元胡可行氣止痛；地龍、鱉甲助牡丹皮活血化瘀之功；且方中川芎在活血養血的同時，亦可行血中之氣，進而增強逐瘀之力。研究[3]表明，ICAM-1 在血管內皮細胞中的表達呈低水平，甚或不表達，但是在炎癥激聯反應被觸發之后，ICAM-1 則會與受體結合，進而激發內皮細胞分泌溶酶蛋白，促進炎性細胞因子的黏附作用，并通過淋巴細胞使得其表達上升。NF-κB 是一種具有多效性的轉錄因子，其可與多種基因啟動子部位的κB 位點發生特異性結合，進而使其發生轉錄表達[4]。

本實驗結果顯示，與空白組比較，各組模型大鼠ICAM-1、NF-кB mRNA 及蛋白的表達均明顯升高（P＜0.05），且以模型組升高最為顯著（P＜0.01）；與模型組比較，膈下逐瘀湯組可極顯著降低ICAM-1、NF-кB mRNA 及蛋白表達水平（P＜0.01）；說明膈下逐瘀湯對輸卵管炎（氣滯血瘀型）模型大鼠具有較好的干預作用，治療效果顯著，值得臨床進一步探究及推廣。