碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌臨床檢測與治療方案的發展及應用

王 粟， 趙 虎

（復旦大學附屬華東醫院檢驗科，上海 200040）

近年來，隨著侵入性診療手段以及廣譜抗菌藥物等的大量使用，多重耐藥（multidrug resistance，MDR）細菌的檢出率呈現快速上升趨勢，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）因耐藥性強而廣、傳播快、感染病死率高而備受關注，被世界衛生組織（World Health Organization，WHO）列為全球耐藥的緊急威脅[1-2]。為了有效預防和控制CRE感染，本期“碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌臨床檢測與治療方案的發展及應用”專題匯集4篇論著和2篇綜述，介紹了CRE的流行病學特征，并對CRE檢測方法和對應治療策略的優缺點進行了總結和比較，以期為臨床CRE感染的預防和診療提供參考。

1 CRE國內外流行現狀

中國CHINET細菌耐藥性監測數據顯示，2005年，碳青霉烯類抗菌藥物對腸桿菌科細菌保持較高的敏感性，耐藥率普遍低于1%；2017年，耐藥率明顯上升，達1.9%～20.0%，尤以肺炎克雷伯菌的耐藥率增長最快（由2005年的0.4%增長到2017年的20.0%）[3]。不同菌種的CRE發生率也有所不同，美國CRE的發生率分別為：肺炎克雷伯菌 11%，大腸埃希菌2%，相關病死率為40%～50%[1]；歐洲肺炎克雷伯菌中碳青霉烯類耐藥株的檢出率為37%，大腸埃希菌中碳青霉烯類耐藥株的檢出率為19%[4-5]；我國CRE的檢出率則快速增加，最高可達15%，患者定植或感染CRE會直接增加住院時長及感染病死率，總體病死率達34%，其菌種構成以肺炎克雷伯菌（74%）為主[6]。

2 CRE的實驗室檢測方法及應用

CRE最常見的耐藥機制是產碳青霉烯酶，其次是高表達超廣譜β-內酰胺酶（extendedspectrum β-lactamase，ESBL）或頭孢菌素酶（ampicillin，AmpC）合并膜孔蛋白突變，而藥物靶點改變和主動外排系統過表達導致的碳青霉烯類耐藥則較為少見[7]。因此，除了體外藥物敏感性試驗外，目前的CRE檢測方法大多通過檢測是否產碳青霉烯酶來判斷CRE菌株。周宏偉等撰寫的《碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的檢測方法》從表型篩選、基因檢測和基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術等方面概述了近十種臨床檢測CRE的方法：傳統的紙片法初篩操作最簡便，但因菌種和耐藥機制不同需選用不同的藥物敏感性試驗紙片[8]；顯色篩選培養基篩選法結合特異性的顯色酶底物及特定的碳青霉烯類抗菌藥物和抑制劑鑒定菌種，但該方法的敏感性和特異性易受顯色培養基中抗菌藥物和抑制劑濃度影響[9]；美國疾病預防與控制中心（the Centers for Disease Control and Prevention，CDC）推薦的肉湯富集法和改良法將抗菌藥物與腸桿菌科細菌同時置于肉湯中培養過夜[10]，再結合改良Hodge試驗和MALDI-TOF MS鑒定結果確證CRE，結果可靠，但操作繁瑣。

美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）在2015年推薦了Carba NP試驗（Carba NP test，CNPt）[11]，基于細菌抽提物水解亞胺培南可改變溶液pH值的原理檢測CRE，該方法快速、成本低，無需大型設備，但需配制特定試劑，可同時檢測多種碳青霉烯酶，但僅適用于腸桿菌科細菌，且對染色體編碼的OXA型碳青霉烯酶的檢測敏感性低，也易出現假陽性結果。CNPt是通過檢測產酶菌株水解對應抗菌藥物發生的生化反應來驗證菌株是否產酶。有學者參照這一原理建立了Polymyxin NP實驗來篩查腸桿菌科中的多黏菌素耐藥菌株[12]。唐瑜等撰寫的《Polymyxin NP實驗篩查腸桿菌科多黏菌素耐藥菌株臨床評價》從體外藥物敏感性試驗、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增多黏菌素耐藥相關基因、實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測多黏菌素耐藥相關的雙組分調控元件等多方面綜合評估了Polymyxin NP實驗篩查多黏菌素耐藥腸桿菌科細菌的臨床價值，發現該方法操作簡便，測定快速，結果可靠，可用于各種機制介導的多黏菌素耐藥腸桿菌科細菌的臨床篩查，可及時指導臨床抗感染治療。

改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）是2017年CLSI在經典的紙片篩選及協同試驗基礎上作出的改進，mCIM將待檢菌株與10 μg美羅培南無菌紙片置于2 mL TSB肉湯共同孵育4 h后，立即將美羅培南紙片取出貼于已涂布有大腸埃希菌（ATCC 25922）的M-H平板上，孵育過夜后測量抑菌圈直徑，通過判斷菌株是否產碳青霉烯酶進而判別CRE。2018年，CLSI再次更新了相關內容，補充了mCIM陽性菌株可再聯合乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活試驗（ethylenediamine tetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM）的結果區分產金屬β-內酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶，以更有針對性地指導臨床用藥[13]。李世榮等撰寫的《雙濃度聯合改良碳青霉烯滅活試驗篩查CRE的臨床應用價值》創新性地評估了雙濃度聯合mCIM篩查CRE的可行性及臨床應用價值。該研究分別配制終濃度為2 μg/mL和4 μg/mL的含美羅培南標準液的TSB肉湯，孵育過夜后轉種中國藍瓊脂平板，檢查菌落生長情況及菌落形態，如果2個濃度均不生長，則為CRE陰性；2個濃度均生長，為CRE陽性；若2 μg/mL濃度生長、4 μg/mL濃度不生長，則需要進一步做mCIM確認CRE。以儀器法分析結果為參考，雙濃度聯合mCIM方法篩查CRE的符合率、敏感性和特異性均高于98%。總體來說，mCIM易操作，無需特殊設備，且能分辨多種碳青霉烯酶基因型，進而細化臨床用藥指導，適合在各種醫療機構的臨床微生物實驗室中推廣使用，但仍然存在耗時長等缺點[14]。

近年來，基因測序等分子生物學技術快速發展與普及，其在臨床微生物實驗室的應用也越來越廣泛，最有代表性的就是通過檢測耐藥基因快速鑒別CRE[13，15]。周宏偉等撰寫的《碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的檢測方法》特別闡述了環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術可直接檢測各種臨床送檢樣本中的耐藥基因，在68℃條件下特異性擴增KPC基因，且不產生其他β-內酰胺酶基因的非特異性擴增，靈敏度可達100 CFU/mL，是普通PCR的10倍，檢測時間也僅需25 min；另外，還有一種基于實時熒光PCR的高靈敏度檢測方法Xpert Carba-R，可同時快速檢測KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48等多種碳青霉烯酶基因，正確率超過97%，但對設備有特殊要求，且耗材成本較高。何麗華等撰寫的《RT-PCR快速檢測產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌臨床應用評價》評估了一種國產試劑盒——肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素KPC基因檢測試劑盒（熒光PCR法）的性能。該研究采用RT-PCR方法直接檢測臨床樣本和菌株中肺炎克雷伯菌外膜磷脂蛋白基因blaphoE和碳青霉烯酶基因blaKPC，用于鑒定和確認耐藥基因，同時進行傳統細菌培養和體外藥物敏感性試驗，發現RT-PCR鑒定肺炎克雷伯菌的靈敏度為100%，特異性為99.38%，與傳統細菌培養法的符合率為99.56%；KPC基因檢測的靈敏度為95.56%，特異性為99.48%，與體外藥物敏感性試驗的符合率為98.67%。該試劑盒檢測僅需2～3 h，高效、簡便，可快速篩查產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，可為重癥感染患者快速提供抗感染治療的依據。總體來看，基于PCR的分子檢測技術與傳統的細菌培養和體外藥物敏感性試驗相比，具備耗時短、敏感性和特異性高的獨特優勢，有助于早期、快速明確CRE感染，幫助臨床及時、合理用藥，但PCR也存在不足：僅能對已知的編碼基因進行擴增，而對目前尚未發現的基因型無法進行預判[16]；若該菌存在未知或罕見的耐藥基因，則會導致CRE檢測結果呈假陰性；且PCR價格昂貴，需要特定設備，對操作人員也有一定的技術要求；后續分析如體外藥物敏感性試驗指導用藥仍需依賴傳統的培養方法[1]。

3 CRE治療方案

CRE菌株因其耐藥譜廣，通常對所有的β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，可供選擇的抗菌藥物有限[5，7]，臨床大多采用聯合用藥方案，但療效不佳[16]。考慮到細菌產生各類β-內酰胺酶是造成腸桿菌科細菌對碳青霉烯類耐藥的主要原因[5]，國內外研究者們開始對β-內酰胺酶抑制劑尤其是新型抑制劑的開發進行了廣泛研究。阿維巴坦（avibactam，AVI）是一種新型的非β-內酰胺類的β-內酰胺酶抑制劑，2015年在美國獲批，與三代頭孢菌素——頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）組合上市，與臨床常用的抑制劑舒巴坦等相比，AVI具有抑酶效果更好、抑制譜更廣的優點，該復合制劑對革蘭陰性桿菌感染有著良好的治療效果[17]。陳濤等撰寫的《頭孢他啶/阿維巴坦單獨和聯合磷霉素對碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌體外抗菌活性研究》探究了這種新型β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑復合劑——CAZ/AVI聯合磷霉素對碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的體外抗菌活性。結果表明，CAZ/AVI聯合磷霉素在體外對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌表現出協同作用，不存在無關和拮抗作用，證實了該聯合方案可通過AVI靶向抑制β-內酰胺酶，CAZ和磷霉素可以無阻礙地破壞細菌細胞壁，以2種不同的策略殺死細菌；唯一的局限是該方案對產金屬β-內酰胺酶的CRE缺乏有效作用。

有研究證實，CRE定植以直腸定植為主，是患者發生CRE感染的獨立危險因素，定植進展為感染的總體風險高達17%，感染病死率也會隨之上升；目前全球普遍存在CRE定植的情況，不同的醫療機構中CRE定植率在0.3%～5.0%[18-19]，在臨床治療CRE感染之前，對CRE定植的患者實行有效的去定植方案也是降低CRE感染率的必要手段[20]。鄒成韻等撰寫的《碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌去定植策略研究現狀》主要闡述了以預防CRE定植進展為感染的去定植策略，包括選擇性消化道凈化與糞菌移植技術，列舉了2種去定植手段的優缺點以及未來需要集中解決的問題。目前主流的去定植方法是口服氨基糖苷類抗菌藥物、多黏菌素E或兩者的組合，最高可將定植肺炎克雷伯菌進展為感染的風險降低80%[21]。盡管目前關于選擇性消化道凈化的研究較多，且已證實對于CRE去定植有一定的效果，但其臨床普及率卻不高，部分國家只在重癥監護病房零星使用[22]。有研究發現糞菌移植實行1周后37.5%的患者無CRE定植，3個月后50%的患者無CRE定植，表明去定植效果良好，但考慮該試驗樣本量較小，且目前相關研究還較為缺乏，糞菌移植去定植CRE的臨床可行性和安全性仍需要更大的隨機和隊列研究驗證[23]。

4 總結

CRE是當前最受國內外關注的耐藥性威脅之一，在我國的流行狀況也異常嚴峻，因此快速、準確地檢測CRE，及時選擇合適的抗感染治療方案對于降低感染率至關重要。隨著各種新技術、新方法的開發和普及，尤其是MALDITOF MS等技術的應用，臨床微生物實驗室已經可以快速檢測出耐藥菌株，明確鑒別CRE，為臨床感染性疾病的預防及診治爭取寶貴時間。但是不同的檢測方法對不同菌種、不同耐藥基因的檢測靈敏度不同，沒有一個單一且理想的方法可以覆蓋所有的耐藥基因，全面地指導臨床用藥。目前對CRE感染的治療尚無國際統一的有效方案，需結合本地區菌株流行特征、藥物敏感性、定植與否及抗菌藥物特點等因素綜合考量。本專題的6篇文章，從檢測和治療的不同角度分別闡述了CRE實驗室診斷方法以及相應的治療策略，為臨床CRE感染的治療及防控提供了參考依據。希望本專題能幫助讀者更好地了解CRE檢測技術及防控策略，更好地服務臨床。