lncRNA SNHG1結合miR-145促進胃癌細胞增殖的機制研究

周鋒利， 褚以忞， 李 吉， 楊大明， 彭海霞， 徐 瑩

（上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院內窺鏡室，上海 200336）

胃癌是我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤[1]。目前,胃鏡篩查尚未在我國全面推廣，多數(shù)胃癌患者就醫(yī)時已處于進展期，5年生存率低，預后往往不佳[2-3]。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機制對提升臨床治療效果有重要的價值及意義。

隨著腫瘤發(fā)病機制研究的不斷豐富，以往曾被認為是無功能的非編碼RNA在腫瘤發(fā)病機制中的作用逐漸被關注。長度大于200 nt的非編碼RNA為長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。目前研究表明，腫瘤中有大量lncRNA的表達異于正常組織[4-5]，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要生物學作用[6]，這使得lncRNA有作為腫瘤生物標志物和治療靶標的潛力[7-8]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長19～25 nt非編碼蛋白的調控小RNA，近年來有大量研究表明，其對腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、侵襲以及遠處轉移等均能產生影響，在腫瘤的診斷中一定的價值[8-12]。

lncRNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）在染色體上位于11q12.3。有研究結果顯示，SNHG1水平在多種腫瘤中升高[13-16]，并可調控腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、Y染色體性別決定區(qū)域盒轉錄因子9（sex determining region Y-box transcription factor 9，SOX9）、鋅指E-盒結合同源異形盒1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）等及其所在信號通路[17]。有研究結果顯示，SNHG1在胃癌中呈高表達[14]，其表達水平與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、生存期有一定關系[18]。微小RNA-145（microRNA-145，miR-145）在胃癌組織中呈低表達，過表達miR-145有抑制胃癌細胞增殖和遷移的作用[19-21]。SNHG1可通過海綿吸附miR-145，促進結腸癌細胞的增殖[22]，但兩者在胃癌中是否有相互作用，并影響胃癌細胞增殖仍有待進一步研究。鑒于SNHG1及miR-145在胃癌組織中的異常表達及對患者預后的影響[14，18]，本研究擬探討SNHG1與miR-145在胃癌發(fā)展中可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

本研究使用的細胞株及pcDNA3.0空載質粒均由上海交通大學醫(yī)學院生化系侯照遠教授實驗室惠贈；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）、RPMI1640、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購自美國Gibco公司；CCK8試劑盒購自日本Dojindo公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告試劑盒及質粒載體購自美國Promega公司；β-連環(huán)蛋白（beta-catenin，CTNNB1）兔單克隆抗體、骨髓瘤病毒原癌基因（myelocytomatosis viral oncogene，MYC）蛋白兔單克隆抗體購自美國CST公司；β-肌動蛋白鼠單克隆抗體購自美國Proteintech公司；二抗購自美國Li-COR公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與組織收集

人胃癌細胞SGC7901、BGC823用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，人腎上皮細胞HEK 293T、人正常胃黏膜細胞GES-1細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均含10% FBS、青霉素50 U/mL、鏈霉素50 μg/mL及L-谷氨酰胺20 mmol/L，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院2016年1月—2017年1月17例胃癌術后患者的胃癌組織及癌旁組織，17例患者中男12例、女5例；年齡≤60歲4例、＞60歲13例；TNM分期為Ⅰ期+Ⅱ期7例、Ⅲ期+Ⅳ期10例；病理類型為腺癌13例、印戒細胞癌4例。

1.3 轉染過表達SNHG1、miR-145及敲低SNHG1

將SNHG1互補DNA（complementary DNA，cDNA）序列（Ensembl：ENSG00000255717，MIM：603222）插入到pcDNA3.0空載質粒中，并按照文獻[23]報道的方法進行質粒轉染，在SGC7901、BGC823及GES-1中過表達SNHG1。人miR-145雙鏈模擬體、SNHG1抑制劑及陰性對照（negative control，NC）由上海吉瑪生物技術有限公司合成，N C雙鏈信息：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3'，5'-AC GUGACACGUUCGGAGAATT -3'。人miR-145雙鏈模擬體：5'-GUCCAGUUUUCCCAGGAAU CCCU-3'，5'-GGAUUCCUGGGAAAACUGGAC UU-3'。SNHG1-homo-128（si-SNHG1-1）：5'-GCCAGCGUUACAGUAAUGUTT-3'，5'-ACA UUACUGUAACGCUGGCTT-3'；SNHG1-homo-582（si-SNHG1-2）：5'-GGUUUGCUGUGUAU CACAUTT-3'，5'-AUGUGAUACACAGCA AACCTT-3'。按說明書方法進行轉染過表達miR-145及敲低SNHG1。

TRIzol法提取細胞和組織中的總RNA，逆轉錄后行實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）定量分析。以小核RNA U6（RNA U6 nuclear small，snRNA U6，U6）為miR-145的內參，以β-actin為SNHG1的內參。miR-145引物序列為：上游5'-CGACCGTCCAGTTTTCCCAGGA-3'，下游5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。U6引物序列為：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。SNHG1引物序列為：上游5'-ACACTGGGAGCC AATGAAACA-3'，下游5'-ACACGAAGTGG AGTTATGGGAAG-3'。β-actin引物序列為：上游5'-GTCACCAACTGGGACGACA-3'，下游5'-CACAGCCTGGATAGCAACG-3'。轉染、TRIzol法提取細胞RNA、逆轉錄后行qRT-PCR。所有實驗均重復3次。

1.4 CCK8及免疫印跡法實驗

CCK8實驗中，將目的細胞以1 000個/孔接種于96孔板，每組設3個復孔；在培養(yǎng)的第2、24、48、72、96 h加入CCK8試劑10 μL/孔，孵育1 h后酶標儀測定450 nm吸光度。實驗重復3次。免疫印跡法實驗中，裂解細胞后，進行蛋白定量、等量蛋白電泳、轉膜、封閉，孵育一抗、二抗后，用Odyssey Li-COR 9120熒光掃描儀（美國Li-COR公司）進行熒光顯影并記錄，實驗重復3次。

1.5 熒光素酶報告基因實驗

為驗證SNHG1有與miR-145的結合位點，構建含有SNHG1預測與miR-145結合位點的片段的psiCHECK2TM質粒，構建方法參考文獻[23]。24孔板培養(yǎng)293T細胞至密度70%～80%，不同量的miR-145或NC與psiCHECK2TM-SNHG1的報告基因質粒同時共轉染，24 h后按說明書操作收集并裂解細胞，設置雙報告基因程序；先在裂解液中加入LARII試劑檢測螢火蟲熒光素酶的活性；之后再加入Stop & Glo Reagent試劑檢測海腎熒光素酶活性；計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值，以此反映psiCHECK2TM-SNHG1的報告基因活性；將實驗組比值除以miR-145 mimics 0 mg組比值，計算出psiCHECK2TM-SNHG1報告基因相對活性，實驗重復3次。

1.6 生物信息學分析

使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/）分析SNHG1表達與胃癌生存期的關系。使用starBase v3.0數(shù)據(jù)庫（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）分析胃癌組織與癌旁組織SNHG1的表達以及胃癌中SNHG1與miR-145、SNHG1與CTNNB1、SNHG1與MYC表達的相關性。采用TANRIC數(shù)據(jù)庫（http：//ibl.mdanderson.org）分析胃癌與SNHG1表達的相關性以及可能與SNHG1存在相互作用的miRNA。通過RNA22 v2 microRNA target detection（https：//cm.jefferson.edu/rna22/）網(wǎng)站預測SNHG1與miR-145可能的結合位點。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。2個組間比較采用t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織中SNHG1的表達及其與患者總生存期（overall survival，OS）的關系

在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/）中使用數(shù)據(jù)集GSE14210（146例）、GSE15459（200例）、GSE22377（43例）、GSE29272（268例）、GSE51105（94例）進行生存分析。結果顯示SNHG1高表達組（127例）中位OS為27.8個月，明顯短于低表達組（221例，中位OS為35.9個月）[風險比（hazard ratio，HR）=1.4（1.06～1.83），P=0.015]，見圖1（a）。

通過starBase v3.0數(shù)據(jù)庫（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）查找發(fā)現(xiàn)，375例胃癌組織SNHG1的相對表達量為3.25（2.60～3.80），明顯高于32例正常胃組織[1.91（1.52～2.32），P=1.4×10-14，錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）=4.3×10-13]，見圖1（b）。

圖1 SNHG1對胃癌OS期的影響及在胃癌及癌旁組織中的表達情況

對17例胃癌患者的胃癌組織及癌旁組織進行qRT-PCR檢測，結果顯示胃癌組織中SNHG1的相對表達量為25.35（4.51～65.12），明顯高于癌旁組織[18.66（8.70～153.90）]（P＜0.05），見圖1（c）。

2.2 SNHG1在胃癌細胞增殖中的作用

CCK8實驗結果顯示，培養(yǎng)48 h后，過表達SNHG1的胃癌細胞系SGC7901和BGC823的增殖速率快于轉染pcDNA3.0空載質粒的胃癌細胞系SGC7901和BGC823（P＜0.05），見圖2（a）～（d）。

在胃癌細胞系SGC7901中敲低SNHG1的表達，采用CCK8實驗檢測細胞增殖速率。結果顯示，與NC比較，培養(yǎng)48 h時轉染siSNHG1-2的SGC7901細胞的增殖受抑制（P＜0.05）；培養(yǎng)72 h后，轉染siSNHG1-1和siSNHG1-2的SGC7901細胞的增殖均受抑制（P＜0.05）。見圖2（e）、（f）。

圖2 SNHG1對胃癌細胞生長的影響

2.3 SNHG1與miR-145在胃癌細胞與組織中的相關性及特異性結合分析

利用生物信息學分析，通過TANRIC數(shù)據(jù)庫（http：//ibl.mdanderson.org） 分析胃癌中與SNHG1表達的相關性以及可能與SNHG1存在相互作用的miRNA。結果顯示，miR-145與SNHG1呈明顯負相關（r=-0.421，P=1.17×10-4），見表1。進一步分析starBase v3.0數(shù)據(jù)庫中372例胃癌患者組織中miR-145與SNHG1的相關性，結果顯示，兩者亦呈負相關（r=-0.37，P=3.81×10-13），見圖3（a）。

在GES-1和SGC7901細胞中分別過表達SNHG1并采用qRT-PCR檢測。結果顯示，隨著SNHG1表達的升高，miR-145表達降低（P＜0.05），見圖3（b）、（c）。

通過RNA22 v2 microRNA target detection（https：//cm.jefferson.edu/rna22/）網(wǎng)站預測到SNHG1與miR-145存在結合位點，見圖3（d）。

熒光素酶報告基因實驗結果顯示，隨著miR-145轉染濃度的上升，SNHG1報告基因的相對活性呈濃度依賴性降低，見圖3（e）。

表1 TANRIC數(shù)據(jù)庫顯示在胃癌中與SNHG1表達水平呈負相關的microRNA

2.4 SNHG1與miR-145結合對CTNNB1、MYC蛋白表達的影響

在starBase v3.0數(shù)據(jù)庫中通過分析372例胃癌患者組織發(fā)現(xiàn)，SNHG1 mRNA表達與CTNNB1（r=0.12，P=0.025）及MYC（r=0.28，P=2.16×10-8）表達均呈正相關，見圖4（a）、（b）。

將miR-145和SNHG1單獨或共轉染至GES-1細胞內，隨后采用免疫印跡法檢測CTNNB1和MYC蛋白的表達。結果顯示，轉染miR-145后，CTNNB1和MYC蛋白水平均明顯降低；轉染SNHG1后，CTNNB1和MYC蛋白水平明顯升高；同時轉染miR145和SNHG1后，miR-145下調CTNNB1和MYC蛋白的作用被明顯抑制。見圖4（c）～（f）。

圖4 SNHG1與miR-145結合對CTNNB1、MYC蛋白表達的影響

3 討論

近年來，隨著生活環(huán)境和飲食結構的改變，STAD發(fā)病率雖有所下降，但其死亡率仍居癌癥死亡率的第3位，占總死亡人數(shù)的8.2%[24]。因此，探究胃癌發(fā)生、發(fā)展的機制，找到新的治療靶點仍極為迫切。SNHG1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個lncRNA，目前發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤的發(fā)展及預后有關鍵作用，即可直接作用于信使RNA（messenger RNA，mRNA），也能通過海綿吸附miRNA，起到競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的作用，影響miRNA對下游靶基因的調控。例如，在結腸癌中通過影響p53通路促進細胞增殖[25]，肝癌細胞中競爭性結合miR-195，封閉其活性，從而促進疾病發(fā)展[26]，在肺腺癌中作用于ZEB1影響靶細胞的增殖、轉移和侵襲等[27]。近來也有報道顯示，SNHG1在胃癌中存在高表達，但其具體的分子作用機制尚未見詳細闡述。褚以忞等[28]的研究結果顯示，在胃癌及癌前病變組織中miR-145水平明顯下降。miR-145可通過影響MYC水平來影響胃癌進展[21]。既往研究也證實，在卵巢癌、胃癌等多種腫瘤中MYC為miR-145的直接靶標[29-31]。同時，MYC也是T細胞因子的靶基因之一，受Wnt/β-catenin信號通路的激活調控[32-33]。

本研究首先通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，胃癌患者SNHG1表達與OS呈負相關，通過starBase v3.0數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SNHG1在胃癌中高表達，與qRT-PCR的檢測結果一致。本研究結果還顯示，過表達SNHG1能促進胃癌細胞增殖，而敲低SNHG1則抑制胃癌細胞增殖。通過TANRIC、starBase v3.0數(shù)據(jù)庫檢索及細胞學實驗證實SNHG1與miR-145表達呈負相關，使用RNA22 v2 microRNA target detection網(wǎng)站預測到SNHG1與miR-145存在結合位點，并通過熒光素酶報告基因實驗證實兩者能有效結合。通過starBase v3.0數(shù)據(jù)庫分析胃癌患者組織發(fā)現(xiàn)，SNHG1表達與CTNNB1及MYC表達均呈正相關。分別過表達miR-145、SNHG1及同時過表達miR-145和SNHG1，發(fā)現(xiàn)miR-145可下調CTNNB1、MYC蛋白表達，SNHG1可促進CTNNB1、MYC蛋白表達，且SNHG1能抑制miR-145下調CTNNB1和MYC蛋白。由此可見，SNHG1在胃癌組織中呈高表達，且能結合miR-145，miR-145對SNHG1的影響呈濃度依賴性。原因可能是SNHG1或能通過海綿吸附miR-145，抑制miR-145對下游靶基因的作用，從而上調miR-145下游CTNNB1、MYC蛋白表達，促進胃癌細胞增殖。因此，SNHG1與miR-145的結合位點可能是胃癌的潛在治療靶點。

由于本研究未用動物實驗進一步闡明胃癌細胞中SNHG1和miR-145通過ceRNA上調CTNNB1、MYC蛋白表達的機制，因此SNHG1/miR-145/CTNNB1/MYC軸對胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響還需進一步研究驗證。