大環內酯類耐藥肺炎支原體研究進展

王冰潔， 張 泓

（上海交通大學附屬兒童醫院 上海市兒童醫院檢驗科，上海 200040）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是上、下呼吸道感染，包括社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）最常見的病原體之一，常引起非典型肺炎，尤其是兒童社區獲得性非典型肺炎，也會同時或依次引起神經系統、消化系統等肺外癥狀[1-4]。各年齡人群均易感MP，但多發于兒童和青少年，易引起暴發流行。MP缺乏細胞壁，對作用于細胞壁的β-內酰胺類抗菌藥物天然耐藥。此外，不推薦兒童使用喹諾酮類和四環素類抗菌藥物。因此，大環內酯類抗菌藥物是治療兒童MP感染的首選藥物[5]。隨著此類藥物的廣泛應用，大環內酯類耐藥肺炎支原體（macrolide-resistantMycoplasma pneumoniae，MRMP）肺炎在世界范圍內蔓延，嚴重限制了兒童患者的治療選擇。本文就MP對大環內酯類抗菌藥物的耐藥情況、耐藥機制及流行基因型和實驗室檢測等進行綜述，以了解MRMP感染的流行病學特征，為疾病的早期診斷和及時治療提供參考。

1 MP大環內酯類抗菌藥物耐藥現狀

自2001年日本首次報道從臨床樣本中分離出MRMP后，亞洲、歐洲和北美洲相繼出現相關報道。MRMP在不同地區的流行差異較大，在中國、日本和韓國等亞洲國家普遍高度流行，在北美洲、歐洲、非洲地區相對低度流行。國內外MP對大環內酯類的耐藥形勢較為嚴峻，美國MRMP占3%～10%[6]，歐洲除意大利（26%）外，其他地區均低于10%[7]，法國大環內酯類耐藥株檢出率為8.3%[8]，德國2016—2018年大環內酯類耐藥率約3%[9]，南非2012—2015年的MP均為敏感株[10]，日本2008—2015年兒童MRMP的檢出率為50%～90%[11]，我國除南京外（20%），北京、上海、新疆、云南和哈爾濱等地兒童MRMP的檢出率仍然較高（66.7%～86.7%）[12]。QU等[13]發現北京2010—2012年兒童MRMP檢出率為94.3%，略高于成人（83.8%），但這種差異與特定的多位點可變數目串聯重復序列分析（multiple-locus variantnumber tandem-repeat assay，MLVA）型別無相關性。韓國2015年MRMP檢出率為87.2%，較2011年的62.9%明顯上升[14]。

有研究結果顯示，日本2008—2012年MRMP檢出率高達81.6%，2013年逐漸降低至43.6%，可能與2011年日本MP治療指南允許對部分MRMP感染患兒使用氟喹諾酮類藥物有關[11]。我國也有研究報道部分地區MRMP檢出率下降，但具體原因仍需進一步分析[12]。相關研究結果[15-16]提示，合理使用抗菌藥物可能是控制MRMP的關鍵。

2 MP對大環內酯類抗菌藥物的耐藥機制

大環內酯類抗菌藥物可結合核糖體50S亞基23SrRNA結構域V區或Ⅱ區的特定核酸，通過使肽酰基tRNA與核糖體提前分離而抑制蛋白質合成，達到抑菌作用。MP耐藥株的體外藥物敏感性試驗結果顯示，23SrRNA點突變與大環內酯類抗菌藥物耐藥高度相關，常見的突變位點是2063、2064和2617[17]。A2063G點突變、A2064G與14元、15元大環內酯類高水平耐藥有關，而2617點突變導致的耐藥性水平相對較低[17-19]。值得注意的是，我國MRMP最常見的是23Sr RNA 結構域V區A2063G突變。北京2010—2012年MP耐藥監測數據表明，分離自成人和兒童的MRMP幾乎都攜帶A2063G突變，2014—2016年分離的53株MRMP中，除1株攜帶A2064G突變外，其他菌株均攜帶A2063G突變[13，17]，與其他文獻[20-21]結果一致。同樣，日本和美國大環內酯類耐藥MP也以A2063G位點突變為主[11，22]。此外，PEREYRE等[23]發現核糖體蛋白L4、L22保守區的缺失或插入也可能導致MP對大環內酯類耐藥，他們用克林霉素和泰利霉素在體外誘導核糖體蛋白L4發生單核苷酸H70R或H70L突變，泰利霉素誘導核糖體蛋白L22出現P112R和A114T替換和111IPRA114缺失。但其他相關研究結果表明，MP臨床分離株中核糖體蛋白L4、L22突變在所有耐藥和敏感菌株中均可出現，與耐藥性無關[15，24]。另外，MP也可能通過主動外排系統或核糖體甲基化修飾等其他機制對大環內酯類抗菌藥物產生抗性[25]。

由于MP的23SrRNA只有1個拷貝，所以單個突變就可以改變大環內酯類耐藥表型，而大環內酯類抗菌藥物的過度使用會增加23SrRNA基因突變的可能性。有研究結果顯示，感染大環內酯類敏感的肺炎支原體（macrolide-sensitive M. pneumoniae，MSMP）的患者在使用阿奇霉素24 d后可發生耐藥突變[15]，大規模使用大環內酯類抗菌藥物后耐藥性克隆的出現頻率顯著增加[16]，提示耐藥菌株的出現與流行可能與大環內酯類抗菌藥物的過度使用有關，合理使用抗菌藥物十分重要。

3 MP的分子流行病學特征

目前常用的MRMP的感染流行病學監測方法有P1基因限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分型和MLVA分型。隨著全基因組測序技術的發展，多位點序列分析（multilocus sequence typing，MLST）和單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）等分辨力更高的分型方法將被用于臨床常規檢測和暴發流行調查[2]。

P1基因RFLP分型方法已被使用了約20年，該法將MP分為P1-Ⅰ型和P-Ⅱ型2種型別。SUN等[26]發現，北京2003—2015年分離的480株MP中，P1-Ⅰ型為主要型別（82.6%～95.4%）。美國、法國也以P1-Ⅰ型為主[8，22]。 俄羅斯、哥倫比亞等國流行P1-Ⅱ型或其變體[27]。除P1基因分型外，MLVA也是一種常用的分子分型方法。MLVA 4-5-7-2和3-5-6-2是主要類型。分別占50.6%～55.1%和14%～20.8%[28-29]。P1基因RFLP分型與MLVA分型有一定關聯，如MLVA-4-5-7-2與P1-Ⅰ型相關，而MLVA3-5-6-2通常屬于P1-Ⅱ型或其變異體[30]。也有研究發現P1基因RFLR分型或MLVA型與大環內脂類耐藥無明顯聯系，其存在多克隆傳播，耐藥基因的不斷出現與治療過程中不斷出現的突變有關，而不是人與人之間的單克隆傳播[2，30]。然而，在多數耐藥率相對較高的研究中，大環內酯類耐藥的MP中檢出的MLVA4-5-7-2顯著多于其他型別，而在非耐藥的菌株中MLVA3-5-6-2為主要優勢型別[12-13，30-31]。我國香港的一項研究發現，2011—2014年MP對大環內酯類抗菌藥物的耐藥率增長了3倍，MLVA單一型別的克隆傳播導致耐藥率的增長，MLVA 4-5-7-2型從25%增長到100%[29]，與其他相關報道[12-13，32]一致。另外，日本對2011—2017年MP的流行病學分析結果表明，2015年后MRMP的檢出率降低與P1-Ⅱ型譜系菌株的增加有關[33]。但目前尚無證據直接證明耐藥與P1基因亞型或MLVA亞型有明顯關聯。2014年，有學者利用MP基因組中8個管家基因（ppa、pgm、gyrB、gmk、glyA、atpA、arcC、andadk）把57株MP分為12個ST型別、2個主要克隆群，其分辨率比P1基因RFLP分型和MLVA分型更高[34]。韓國學者用MLST把2000—2016年146株MP臨床分離株分為8個ST型別，其中常見的是ST3型和ST14型，分別占74.7%和15.1%，其中98.3%的MRMP為ST3型[35]。日本2002—2016年MP中最常見的型別是ST3，而MRMP主要為ST3（74.6%）和ST19（11.4%）[36]。這些研究結果均表明ST3型的克隆傳播可能與MRMP的增加有關。

4 實驗室檢測方法

控制MRMP感染的重要措施是早期快速檢出MP及耐藥MP，從而指導臨床治療。MP分離培養和體外藥物敏感性試驗是診斷MRMP感染和治療的金標準，但由于生長條件要求苛刻，且培養周期長，結果受多種因素影響，不適合常規檢查。建立新的快速檢測方法，如目前臨床常用的聚合酶鏈反應擴增法，具有快速、靈敏的優點，有助于及時控制MRMP的暴發流行[37]。

4.1 常規方法

MP培養法是世界衛生組織推薦的診斷金標準，可分為固體培養法和快速液體培養法。MP固體培養法需要2～4周時間，靈敏度也較低，盡管隨著培養基的改進，其敏感性得到一定程度的提高，但特異性仍較低，易受其他微生物的污染而出現假陽性。血清學檢測方法由于快速、經濟的優點而在臨床中被廣泛應用，但通常需要收集急性期和恢復期雙份血清，抗體滴度呈4倍或4倍以上增高或減低時才有意義，且耗時2～3周，結果受抗體產生、患者年齡、免疫功能的影響，如某些輕度感染者或嬰幼兒及免疫缺陷者不能產生抗體，會導致漏診，也不宜作為早期快速診斷方法[38-39]。

4.2 分子生物學檢測技術

近年來，臨床常用核酸擴增技術檢測MP的DNA或RNA，常用的實驗方法有傳統聚合酶鏈反應、實時定量聚合酶鏈反應和環介導等溫擴增技術等，常用的擴增靶基因有P1黏附蛋白基因、16S rRNA、ATP酶基因和各種轉錄翻譯因子等。這類技術具有特異性高，檢測速度快等優點，具有廣泛的應用前景[40]。

胡文娟等[41]建立了新型MP實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測方法，并與傳統的巢式聚合酶鏈反應、分離培養法等進行對比，總符合率分別達88.1%、83.5%，且檢測靈敏度可達10拷貝，更快速、經濟，具有很高的科研和臨床應用價值。環介導等溫擴增技術是一種較新的直接檢測臨床標本中多種微生物的等溫擴增技術，其利用寡核苷酸引物和鏈置換聚合酶在恒溫下擴增目的片段，結果肉眼可見。該方法目前已被成功運用于檢測MP。YUAN等[42]使用環介導等溫擴增技術在北京307醫院2016—2017年收集的125份標本中檢出43例MP，而實時定量聚合酶鏈反應檢出40例。提示環介導等溫擴增技術具有很高的特異性和靈敏度，尤其適合MP的快速檢測，在兒童患者中有很好的應用前景。

目前，學者們對MP是否為上呼吸道正常菌群存在爭議。有研究結果表明，健康人上呼吸道MP攜帶率很高，且死亡MP的DNA可持續7個月之久，血清學方法和實時定量聚合酶鏈反應不能區分無癥狀攜帶和感染[43-44]。而RNA只存在于增殖存活的病原體內，故以RNA為基礎的檢測MP RNA放大技術能夠區分MP的感染和攜帶。實時熒光核酸恒溫擴增檢測（simultaneous amplification and testing，SAT）技術是我國自主研發的專利技術，通過磁珠法提取特異性核酸，具有很高的特異性，目前在結核分枝桿菌檢測中應用廣泛，但在MP檢測中應用較少。LI等[45]分別采用MP-SAT、實時定量聚合酶鏈反應檢測315例患兒MP，發現兩者具有較好的一致性，且SAT具有更高的特異性和敏感性。

目前，一般采用體外藥物敏感性試驗分析MP對大環內酯類抗菌藥物的耐藥情況，但由于MP培養條件苛刻，臨床實驗室一般無法常規開展。大環內酯類抗菌藥物耐藥性的產生多與23SrRNA結構域Ⅱ區和V區基因位點突變有關。目前臨床上主要通過熒光定量聚合酶鏈反應和測序技術快速檢測耐藥性點突變進行耐藥分析，如Sanger測序法和實時聚合酶鏈反應-高分辨率熔解曲線（polymerase chain reaction-high resolution melting，PCR-HRM）。最近有研究結果表明，有商業化試劑盒通過熔解曲線分析MP耐藥突變，與測序法比較，敏感性和特異性均為100%[46]。美國疾病預防與控制中心也使用PCR-HRM檢測在MP暴發流行中的大環內酯類耐藥突變[47]，但很少有方法可以同時檢測MP及其耐藥性突變。有學者設計了一種實時定量聚合酶鏈反應方法，可以從臨床標本中快速檢測MP，并同時快速檢測23SrRNA 3個常見的耐藥突變[48]。LIU等[49]開發了一種循環探針法，利用RNA和DNA構成的嵌合cycling探針，可以快速檢測出MP，并區分出耐藥突變株，與傳統聚合酶鏈反應有良好的一致性。

核酸擴增方法有助于更好地了解MP的流行病學特征，可為臨床治療提供一定的依據。但是目前尚無統一的檢測標準，故還未常規應用于臨床。我們仍需探索更適用于臨床的MP檢測方法，指導臨床制定合理的治療方案，獲得理想的治療效果。