SARS-Cov-2核酸檢測結果解讀與臨床應用

姜佳慧， 林源吉， 余道軍

（1.浙江中醫藥大學第四臨床醫學院，浙江 杭州 310000；2.杭州百邁生物股份有限公司，浙江 杭州 310000）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情早期階段，在疾病的早期診斷、監測及各項實驗室檢測指標中，以嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）核酸檢測應用最廣，臨床意義最大。本文對SARS-Cov-2核酸檢測結果解讀與臨床應用進行綜述，以期為臨床診斷提供參考。

1 SARS-CoV-2核酸檢測結果解讀

到目前為止，我國國家衛生健康委已經發布了7版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》[1]，均將SARS-CoV-2核酸檢測陽性作為COVID-19確診的主要指標。SARS-CoV-2核酸檢測的靶基因為ORF1ab基因、N基因和E基因，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應快速擴增靶基因[2]，可在2 h內明確是否存在SARS-CoV-2。因此，檢測SARS-CoV-2核酸作為實驗室病原學診斷標準是合適的。但SARS-CoV-2核酸檢測不能作為COVID-19實驗室病原學診斷的“金標準”，真正的“金標準”應該是從患者標本中分離出SARS-CoV-2。我們對SARS-CoV-2的認識及其基因序列的獲得都是基于從患者體內分離出病毒，并對其進行全基因測序，通過分析病毒基因組，篩選出病毒保守基因，然后開發出用于SARS-CoV-2核酸檢測的診斷試劑。目前在用的SARS-CoV-2核酸檢測試劑基本上都是基于這種模式。

雖然COVID-19病原學診斷的“金標準”是病毒分離，但由于病毒分離技術要求高、成功率相對較低，且速度慢，不能滿足臨床快速診斷及鑒別診斷的需要。而SARS-CoV-2核酸檢測速度快、特異性高，因此，病原學診斷還是依賴于核酸檢測，病毒分離技術主要用于科學研究和疫苗開發等領域。

2 用于SARS-Cov-2核酸檢測的標本類型

可用于SARS-CoV-2核酸檢測的標本種類較多，主要包括呼吸道標本、消化道標本和血液標本等。

2.1 呼吸道標本

目前臨床上應用最多的標本是呼吸道標本，尤以鼻咽拭子最為普遍[1-2]。對于SARS-CoV-2核酸檢測，下呼吸道標本（痰液或氣道抽取物）結果更加準確[1]。但相對于氣道抽取物，痰液標本采集較為方便，一般臨床實驗室主要用鼻拭子，輔以痰液標本。在檢測SARS-CoV-2核酸時，有時會遇到鼻拭子檢測陰性而痰液檢測陽性的現象。雖然痰液標本SARS-CoV-2核酸檢測陽性率高于鼻咽拭子，但臨床應用最多的還是鼻咽拭子，原因主要有2個方面：一是鼻咽拭子采集較為方便、快捷，可以多次重復采樣；二是SARSCoV-2感染患者臨床表現多為干咳[3]，痰液較少，所以痰液標本采集困難。因鼻咽拭子中病毒載量相對有限，且對采樣要求較高（需要采集到足夠的呼吸道上皮細胞），故鼻咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性率不高，且可能出現陰性、陽性交替出現的現象。

2.2 糞便標本

在COVID-19疫情早期，很少有人重視消化道標本的核酸檢測，隨著對疾病認識的加深，臨床實驗室越來越多地采集糞便或肛拭子檢測SARSCoV-2核酸[4]，且陽性率也不低，甚至出現鼻咽拭子核酸陰性而糞便核酸陽性的現象。SARS-CoV-2主要與血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）-2受體結合[5]。有研究結果表明，ACE-2在肺部組織和小腸組織表達最豐富，且在幾乎所有器官的內皮細胞和平滑肌細胞上的表達也很豐富[6]，SARS-CoV-2一旦進入肺部組織和腸道組織，會很快在組織內復制。因此，臨床上檢測SARS-CoV-2核酸，以呼吸道和消化道樣本陽性為主。由于目前尚未見消化道感染致死的病例報道，因此SARS-CoV-2對消化系統的致病力是否與呼吸系統一致尚需進一步探討。SARS-CoV-2可能主要通過呼吸-消化系統途徑感染消化道。咽是呼吸和消化系統的共同通道，分別與鼻腔、口腔和喉腔相通，COVID-19患者呼吸不暢、氣道受損，會通過口-鼻呼吸，或者在干咳、打噴嚏等過程中發生吞咽運動，此時從呼吸道排出的病毒會通過吞咽運動進入消化道，而腸道上皮細胞富含ACE-2受體，導致病毒二次感染消化道，因為是二次感染，其毒力相對較弱；另外，SARS-CoV-2對消化系統的毒力可能相對較弱，因此臨床表現以呼吸系統癥狀為主，消化系統癥狀相對較輕。病毒在腸道內復制后，可以通過糞便被排出體外，因此，糞便SARS-CoV-2核酸檢測會出現陽性結果。當然，還有一種可能，病毒在通過呼吸-消化途徑進入腸道后，被胃腸道消化酶、鹽酸等殺滅，但病毒核酸依然存在，通過腸道被排出體外。SARS-CoV-2是否在消化道被殺滅，既與進入消化系統的病毒載量密切相關，也與患者消化功能有關。不同患者糞便標本核酸檢測結果差異很大，進入消化系統病毒載量大、消化功能相對較弱的患者的糞便核酸檢測陽性率高，且可能存在時間相對較長，反之則陽性率低或存在時間短。

總之，SARS-CoV-2對消化系統的毒力遠遠小于呼吸系統。在治療上，臨床上主要針對呼吸系統進行救治，對于病毒所致的消化系統癥狀諸如腹瀉等，不建議進行止瀉治療，建議以調節酸堿平衡和水液平衡，保持內環境穩定為主，通過腹瀉將病毒排出體外，更利于縮短康復時間。

2.3 血液標本

采用血液標本檢測SARS-CoV-2核酸存在一定爭議，SARS-CoV-2不易進入血流，即使進入，病毒載量也很低，或存在時間很短。只有危重患者血管屏障遭受破壞或者血管通透性增加，SARS-CoV-2才能進入血流，導致病毒血癥。但在病毒血癥患者的血流中，病毒存在時間不長，因此采血時機很難把握。這導致血液標本SARS-CoV-2核酸檢測陽性率很低，不適用于SARS-CoV-2核酸檢測。

2.4 其他標本

目前還有眼部分泌物、空氣等標本SARSCoV-2核酸檢測陽性的報道，但此類報道僅為個例，且不排除標本被污染的可能。眼分泌物核酸陽性不排除患者手污染病毒后再接觸眼睛導致眼部被感染的可能。空氣中檢測到SARSCoV-2核酸陽性，一般認為是感染者飛沫污染所致。因此，眼部分泌物、空氣等標本檢測SARSCoV-2核酸的臨床意義不大。

3 病毒核酸檢測假陰性、假陽性問題

在SARS-CoV-2核酸檢測過程中，經常會出現臨床表現高度疑似COVID-19，但核酸檢測陰性的情況，因此有學者建議以影像學檢查代替核酸檢測。造成SARS-CoV-2核酸檢測假陰性的因素很多，涉及分析前、中、后的每個環節，包括病程病情、標本采集、檢測試劑盒、實驗操作和儀器性能、結果解讀等，其中尤以分析前（標本采集）因素最為顯著。

3.1 分析前因素

分析前因素對檢驗結果的影響較大，標本采集、保存和運輸等分析前因素難以把控。COVID-19患者臨床表現以干咳為主，呼吸道分泌物相對較少，因此病毒黏附于鼻咽部位較少，且存在時間也較短，所以采樣過程中如未嚴格按照規范采樣，采樣時間短、鼻咽拭子插入鼻腔深度不夠、在鼻咽部擦拭力度不足、范圍小、患者鼻咽部位暴露不充分（沒有讓患者頭部后仰）等均可導致不同采樣人員、不同采集時間送檢的鼻咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測結果差異很大。

3.2 分析中因素

對于成熟的檢驗方法，分析中的影響因素已經很小，但SARS-CoV-2核酸檢測分析中影響因素也不能忽視。

3.2.1 試劑盒因素 COVID-19是新發傳染病，以往沒有針對SARS-CoV-2的核酸檢測試劑，2020年初獲得病毒全基因序列后，分子診斷研發人員根據生物信息學理論篩選出SARSCoV-2保守序列，并基于理論上的保守序列短期內開發出SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒。因為COVID-19傳染性極強，迫切需要快速診斷以行隔離或治療處理。因此，我國相關部門通過綠色通道緊急審批了病毒核酸檢測試劑，并立即投入臨床檢驗。SARS-CoV-2核酸檢測試劑是基于逆轉錄熒光定量PCR技術的3類分子診斷試劑，從立項研發到臨床應用一般需要2～3年時間[7]，但由于SARS-CoV-2核酸檢測試劑的臨床驗證病例數及應用時間不足，其準確性、穩定性、檢測限、精密度等性能指標無法保證，因此，初期SARS-CoV-2核酸檢測出現假陰性、假陽性也與試劑檢測性能有關。目前，SARSCoV-2核酸檢測試劑有ORF1ab基因、N基因、E基因3個檢測靶基因，不同品牌試劑檢測靶基因數目不同，大部分采用雙靶點，但也有少數品牌采用單靶點或三靶點。對于2個或3個靶基因試劑出現單靶基因 “陽性”的情況，一般實驗室會重新采集標本復檢，只有2次結果一致且2個或3基因同時陽性，實驗室才會出具陽性報告。所以，因試劑原因導致的假陽性比例極小。在疫情初期，臨床實驗室檢測SARS-CoV-2核酸時，為避免因試劑原因造成的假陰性，一般采用2～3個不同品牌試劑進行平行檢測，盡量保證檢測結果的準確、可靠。隨著SARSCoV-2核酸檢測試劑的不斷研發，檢測結果假陰性問題已基本不會對COVID-19的診治造成困擾。

3.2.2 實驗操作 因SARS-CoV-2具有強傳染性，檢驗人員在進行病毒核酸檢測時，應在具有負壓的二級生物安全實驗室（P2+實驗室）內進行實驗操作。但疫情初期，大多醫院沒有配備負壓實驗室，病毒核酸檢測一般只能在普通二級生物安全實驗室進行，實驗室人員做好三級生物安全防護[8]，這種情況對實驗操作或多或少都有影響，不同的檢驗人員操作規范性不同，對檢測結果會有一定影響。

3.2.3 儀器性能 隨著檢驗技術的發展和管理的規范化，醫學實驗室一般都會對儀器進行性能驗證，儀器性能對檢驗結果的影響相對很小。

3.3 分析后因素

臨床實驗室在報告SARS-CoV-2核酸檢測陽性結果時，一般都會與臨床充分溝通，保證陽性結果的可靠性。但是，對于病毒核酸檢測陰性結果，實驗室與臨床的溝通不夠充分，一般直接出陰性報告，可能會對檢測結果的準確性產生一定的影響。

4 COVID-19出院標準中關于SARS-CoV-2核酸檢測指標的應用

隨著對疾病認識的加深，最新版診療方案規定患者呼吸道和糞便標本2次核酸檢測陰性才可出院[1]。如能組建有檢驗專家參與的COVID-19患者出院專家組，不完全根據SARS-CoV-2核酸檢測的陰、陽性結果決定是否可以出院，對COVID-19患者出院標準的把握會更為可靠。COVID-19出院患者復檢核酸陽性，并不一定是復發，有可能是出院前2次核酸檢測為假陰性結果。這類患者臨床上可能已經真正痊愈，但是體內可能仍然存在少量病毒，此時行呼吸道標本核酸檢測可能出現陰性結果，若采樣不規范，或沒有采集到足夠量的標本，出現假陰性的概率相對較大。患者出院后，體內的病毒可能還會在體內復制，所以復檢可能再次出現陽性結果。對于此類出院患者，只要未出現臨床復發，僅僅病毒核酸陽性，在臨床處置上應與初發COVID-19患者區別對待，建議臨床上采取隔離觀察，防止傳染他人，如出現臨床癥狀，再入定點醫院進行治療。糞便標本核酸檢測的臨床意義沒有呼吸道標本大，且糞便核酸陽性不代表體內存在活病毒，建議糞便標本SARSCoV-2核酸檢測作為輔助出院指標比較好，不宜作為硬性出院指標。

5 總結

SARS-CoV-2核酸檢測的病原學確診意義毋庸置疑，臨床標本采集的規范性對檢測結果的影響最為顯著。SARS-CoV-2在體內存活的時間因患者免疫力的不同而有差異。COVID-19患者出院后SARS-CoV-2核酸檢測結果“復陽”不一定是疾病復發，有可能與與核酸檢測假陰性（標本采集原因）有關，對于此類患者應與初發患者區別對待。 非呼吸道標本SARS-CoV-2核酸檢測臨床意義相對較小，作為參考即可。臨床實驗室應發揮自身專業優勢，正確解讀相關檢測結果，為臨床提供科學、客觀的實驗室意見。