一種富氧溫控型骨組織工程材料的構建及性能評價

王宇清，劉國輝，劉長安，康強軍，王凌云，任維娜，鞏進平

在現代戰爭條件下，由于高能爆炸性武器的應用和火器傷本身復雜性的原因，戰創傷性的骨缺損發生率較高，且治療非常困難。如何高效地修復并重建此類損傷所導致的骨缺損、骨不連甚至骨壞死已成為目前骨科研究的重點課題[1-2]。雖然應用自體骨移植修復骨缺損是目前臨床最可靠的治療方法，但是自體骨移植的并發癥嚴重限制了其臨床應用[3]。因此，應用組織工程學原理構建各種骨移植替代材料成為目前骨缺損治療的趨勢[4-5]。然而，越來越多的研究者發現，由于骨組織工程材料體積較大或血管化慢的原因，損傷后骨缺損及周圍組織早期的低氧環境無法改善，從而導致修復效果變差[6-8]。而且，低氧環境會嚴重阻礙骨的再生，不利于支架內種子細胞的存活，從而在很大程度上限制了材料修復骨缺損效能的發揮。因此構建一種能夠釋放氧氣于骨缺損部位的富氧骨移植替代材料，改善材料移植后早期的低氧環境是促進骨缺損修復的新希望。1-溴十七氟辛烷作為一種全氟碳化合物，其具有良好的儲氧和釋氧能力，在血液組織工程領域已被用于臨床試驗[9]。然而，將其應用于骨組織工程學研究尚未見報道。另外，學者們發現將殼聚糖(CS)、β-甘油磷酸鈉(β-GP)和羥乙基纖維素(HEC)按照一定的比例混合，可以構建一種在體溫(37℃)條件下凝固的水凝膠[10]，其無毒無害，具有可降解性、生物相容性、緩釋性等多種優點，在骨組織工程領域已被廣泛應用[11-12]。本實驗首次構建了不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料，并檢測和比較其一般理化特性和釋氧能力等，對表現較好的一組進行掃描電鏡、細胞毒性、組織相容性等檢測?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1主要實驗試劑與儀器 1-溴十七氟辛烷(美國Sigma公司)；高脫乙酰度CS(美國Sigma公司)；β-GP(美國Sigma公司)；HEC(中國阿拉丁)；蛋黃卵磷脂(中國索萊寶)；超聲乳化儀(美國Sonics公司)；高壓氧艙(白求恩國際和平醫院)；恒溫水浴槽(中國成都儀器廠)；電子pH檢測儀(中國上海儀電公司PHS-3C型)；CG 8+型血氣分析系統(美國雅培公司)；掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)；分光光度儀(中國雷杜生命科技)；光學電子顯微鏡及圖像采集系統(日本尼康ECLIPSE100型)。

1.3實驗方法

1.3.1不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料的制備

1.3.1.11-溴十七氟辛烷濃度為5%的富氧溫控型骨組織工程材料：A液配置方法為CS粉劑0.75 g溶于25 ml濃度為0.1 mol/L的鹽酸溶液中，與β-GP粉劑1.725 g溶于去離子水10 ml混合，充分攪拌直至混合液透明，4℃冰箱中靜置過夜充分溶解后，先后用1.2 μm和0.22 μm的超濾膜加壓過濾除菌，密封后4℃保存備用。B液的配置：按照我們以往經驗，蛋黃卵磷脂95 mg加入Tyrode鹽緩沖液850 μl中，用超聲乳化儀乳化2次，每次1 min，得到輔助乳化液備用。將1-溴十七氟辛烷原液150 μl與上述輔助乳化液混合后，用超聲乳化儀乳化10次,每次1 min，得到1 ml 15%的1-溴十七氟辛烷乳液，用0.8 μm的超濾膜加壓過濾除菌后，高壓氧艙內充分充氧，密封后4℃保存備用。C液的配置：HEC粉末0.375 g溶于去離子水10 ml中，在室溫環境下，充分攪拌溶解后，用0.22 μm的超濾膜加壓過濾除菌，密封后4℃保存備用。最后，將上述A、B、C三種液體，按照4∶2.5∶1的體積比例，在無菌臺上充分混合后，制備得到1-溴十七氟辛烷濃度為5%的富氧溫控型骨組織工程材料原液，密封后4℃保存備用。

1.3.1.21-溴十七氟辛烷濃度為10%的富氧溫控型骨組織工程材料：按照上述方法分別配置A和C兩種基礎溶液，通過改變上述B液配方中1-溴十七氟辛烷原液的比例，得到1 ml 30%的1-溴十七氟辛烷乳液(B1液)，用0.8 μm的超濾膜加壓過濾除菌后，高壓氧艙內充分充氧，密封后4℃保存備用。最后，將上述A、B1、C三種液體，按照4∶2.5∶1的體積比例，在無菌臺上充分混合后，制備得到1-溴十七氟辛烷濃度為10%的富氧溫控型骨組織工程材料原液，密封后4℃保存備用。

1.3.2體溫下凝固時間的測定：將5%和10%濃度的1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料原液置于凍存管內(n=10)，于37℃環境下進行倒置。完全凝固的標準為：將材料放入37℃環境下開始計時，30 s觀察1次，觀察方式為將凍存管90°倒置，以30 s內凝固的膠凍肉眼下無變形為完全凝固，該時間標記為凝固時間。該實驗重復5次，取均值記錄2種濃度材料的凝固時間。

1.3.3pH值測定:在室溫下(約25℃左右)，用電子pH檢測儀測量5%和10%濃度的1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料原液的pH值，每組測量5個樣本，每個樣本重復測量5次，取均值記錄2種濃度材料原液的pH值。

1.3.4釋氧曲線的測定:在37℃環境下，制備2種不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料于凍存管內(n=5)，每支試管內材料體積均為1 cm×1 cm×1 cm，然后往各個試管內加入10 ml的Tyrode鹽緩沖液，試管密封后，置于37℃恒溫水浴槽內，放置10 d，每天同一時間點內于各個試管內提取少量浸提液用CG 8+型血氣分析系統檢測氧分壓，取均值記錄并繪制釋氧曲線。

1.3.5掃描電鏡觀察：選取較優釋氧性能的富氧溫控型骨組織工程材料，經過多聚甲醛固定、沖洗、抽真空脫水凍干后，修裁出樣本的橫截面，噴金鍍膜后(厚度為10 nm)用Quanta250型掃描電子顯微鏡觀察其截面的超微結構。

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1.3.6細胞毒性試驗[13]：選取較優釋氧性能的富氧溫控型骨組織工程材料1 cm×1 cm×1 cm，無菌條件下用10 ml的Tyrode鹽緩沖液密封后浸泡10 d，用于制備材料浸提液。將8 ml的材料浸提液與0.2 ml稀釋后的抗凝兔血相混合，37℃恒溫培養箱內孵育1 h，高速離心后，吸取上清液用于吸光度OD值的檢測，以檢測材料是否對血液細胞具有毒性(n=5)。為了方便對照，我們用8 ml蒸餾水和8 ml生理鹽水分別制備陽性對照和陰性對照。分光光度儀測量波長均為545 nm。

1.3.7生物相容性檢測：12只新西蘭白兔麻醉后，右側大腿常規備皮、消毒，切開皮膚，鈍性分離大腿部位肌肉組織后，將選取的較優釋氧性能的富氧溫控型骨組織工程材料1 cm×1 cm×1 cm包埋于右側大腿肌肉組織內(手術中未損傷肌纖維)。術后，各組動物歸籠常規飼養，密切觀察術后傷口愈合情況。分別于術后2、4、6、8周(n=3)取植入的材料及包埋處周圍的肌肉組織，4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規切片后進行HE 染色，觀察材料的生物相容性情況。

2 結果

2.1富氧溫控型骨組織工程材料的理化性質檢測結果 2種濃度的富氧溫控型骨組織工程材料均可在37℃環境下，經過4.5 min凝固成膠凍樣狀態，具有一定的機械強度，2組凝固時間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。2種濃度的富氧溫控型骨組織工程材料原液pH值均值為6.7左右，接近中性，2種濃度材料的pH值比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.2釋氧能力檢測結果 隨著時間延長，2種濃度材料浸提液中氧分壓呈上升趨勢，并在7 d達到峰值，10 d內均可持續釋放氧氣，且10%濃度組在1～10 d的各個時間點的氧分壓明顯高于5%濃度組(P<0.01)。因此，與5%濃度組相比，1-溴十七氟辛烷濃度為10%的材料釋氧效能更高。見圖3。

圖1 不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料凝固時間比較

圖2 不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料原液pH值比較

圖3 不同1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料的釋氧曲線

與5%濃度1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料比較，bP<0.01

2.3掃描電鏡檢測結果 對10%濃度1-溴十七氟辛烷濃度的富氧溫控型骨組織工程材料進行掃描電鏡觀察結果顯示：材料橫斷面為無定向結構，且較多粗細不等的纖維交織成三維立體網狀(圖4A)，結構內微孔孔徑較為均一，直徑在100～200 μm(圖4B)。

2.4細胞毒性檢測結果 對材料浸提液進行稀釋后抗凝兔血混合實驗的結果顯示：材料浸提液組和生理鹽水組的混合液均為無色透明，而蒸餾水組的混合液明顯呈淡紅色，且材料浸提液組和生理鹽水組的OD值比較差異無統計學意義(P>0.05)，而蒸餾水組的OD值高于材料浸提液組(P<0.01)。見圖5。

圖4 10%濃度1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料的超微結構

A.材料的橫斷面為由較多粗細不等的纖維交織成的無定向網狀結構；B.結構內微孔孔徑較均一，直徑100～200 μm

2.5生物相容性檢測結果 本實驗中所有動物無死亡，傷口無感染，均符合實驗要求，并納入實驗分析。對植入材料及周圍肌肉組織的HE染色結果顯示：術后2周，大體見：植入材料明顯縮小，局部分割被包膜包裹，未見膿液及周圍肌肉壞死組織；鏡下見：植入材料為大片均質紅染物質，材料周圍可見多數多核炎性細胞浸潤和成纖維細胞增生，材料內見少許多核炎癥細胞浸潤，周圍肌纖維萎縮，未見明顯溶解壞死。術后4周，大體見：植入材料進一步萎縮，部分植入物血管化較明顯，觸之易出血且活動度差；鏡下見：均質紅染物質內大量肉芽組織長入，多核炎癥細胞明顯減少，周圍肌纖維形態正常，未見明顯纖維化和壞死表現。術后6周，大體見：未見膠凍樣移植物殘留，部分個體遺留少量瘢痕組織，周圍肌肉組織稍顯腫脹；鏡下見：未見均質紅染物質，周圍肌纖維形態正常，可見少許多核炎癥細胞；術后8周，大體和鏡下均見正常肌肉組織。見圖6。

圖5 10%濃度1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料的細胞毒性檢測

與材料浸提液組比較，bP<0.01

圖6 10%濃度1-溴十七氟辛烷富氧溫控型骨組織工程材料的生物相容性實驗結果(HE)
A、B為術后2周；C、D為術后4周；E、F為術后6周；G、H為術后8周

3 討論

骨的修復過程是一個需要大量氧氣和營養物質的過程。臨床上骨缺損或骨不連的發生，大多是由于損傷局部缺氧、缺血，從而發生骨梗死等原因導致的。有研究證實，高壓氧可以使成骨細胞表達更多的骨形態形成蛋白(BMP-2)，刺激成骨活動，抑制破骨活動，從而促進骨的再生[14]。因此，在骨的修復過程中，損傷局部由始至終的充分氧供被研究者認為至關重要。目前，臨床上應用自體骨移植修復骨缺損是治療骨缺損的金標準，而且帶血供的骨瓣移植明顯優于游離自體骨移植的修復效果，可能是因為帶血供的骨瓣移植早期局部的氧供狀態明顯優于未血管化的游離自體骨移植。然而，由于帶血供的骨瓣移植要求特殊解剖學特點的局限性和自體游離骨移植的并發癥限制了其臨床應用。因此，應用組織工程學原理構建各種骨移植替代材料成為目前骨缺損治療的趨勢。但是，研究者們同樣發現，移植局部由始至終的充分氧供同樣限制了組織工程骨的應用。研究者普遍認為，隨著組織工程支架的增大和移植后支架血管化較慢的原因，支架內部的早期低氧環境無法改善，往往導致支架內部種子細胞凋亡，從而使其促進成骨的能力下降。在骨組織工程學中，骨髓基質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)被認為是“黃金種子細胞”，具有明顯的促進成骨的效能。有研究證實，在體外實驗中，厭氧環境可以明顯阻礙MSCs向成骨細胞分化[15]；而有效的富氧環境可以有效地促進MSCs的存活和增殖，并下調MSCs部分低氧基因的表達，阻礙其向軟骨細胞分化，促進其向成骨細胞分化，從而達到成骨效果[8]。因此，在骨組織工程支架的構建中，改善支架內部的低氧環境對于其成骨效能的最大化至關重要。

具有富氧特性的全氟碳化合物PFCs的出現為組織工程學解決早期低氧環境提供了新的解決方案。PFCs是一類具有類似結構的高分子惰性化合物，其化學性質穩定，無毒無害、親脂、疏水，具有較好的生物相容性，在體內雖然不降解代謝，但可被吸收入血后經肺臟排出體外。更重要的是，該化合物具有良好的氣體溶解度，其氧氣溶解度是血液的2～3倍，作為良好的呼吸氣體運載體，最早被廣泛應用于人造血液、器官移植保存液等方面的研究。在骨組織工程領域，全氟碳化合物同樣得到了廣泛的應用。將全氟碳化合物PFTBA與MSCs水凝膠相復合用于大鼠骨缺損的治療，PFTBA可以有效改善移植部位的低氧環境，促進MSCs的存活和分化，促進移植物血管化程度和骨再生[7]。進一步的體外機制研究表明，PFTBA不僅可促進MSCs的存活，而且可以通過調整基因表達，阻礙其向軟骨細胞分化，促進其向成骨細胞分化[8]。在血液組織工程學、神經組織工程學及慢性潰瘍的修復等方面，全氟碳化合物尤其是PFTBA同樣被證實可以有效改善低氧環境，促進修復效果。然而，目前將PFTBA用于臨床的實驗研究較少見。本實驗中采用的1-溴十七氟辛烷同樣是一種全氟碳化合物，具有富氧劑特有的上述特性，作為第二代“人造血液”Oxygent的主要成分，已被應用于Ⅲ期臨床試驗[16-17]。

CS水凝膠是一種常用的組織工程材料，被廣泛應用于皮膚、神經、藥物緩釋系統等領域[18]。在骨組織工程領域，由于水凝膠本身的機械強度較差，水凝膠往往與其他機械強度較好的骨組織工程材料相復合，通過發揮其快速降解、促進成骨、藥物緩釋等優點，在骨組織工程領域發揮作用[19-22]。通過對CS水凝膠制備工藝的進一步改進，研究者們制備出了CS-β-GP-HEC溫控型水凝膠，該水凝膠在常溫狀態下呈液體狀態，一旦注入體內37℃的環境下即可在短時間內凝固[23-25]。將種子細胞、細胞因子和其他藥物成分與該溫控型水凝膠相復合，填充于其他機械性能較好的骨移植材料當中，便于上述成分在修復材料中的均勻分布和緩釋效果的發揮，從而使修復效能最大化。

在本實驗中，我們將增氧劑1-溴十七氟辛烷復合入改良后的CS-β-GP-HEC水凝膠中，制備含有增氧劑1-溴十七氟辛烷的富氧溫控型骨組織工程材料。通過對不同增氧劑濃度的材料進行凝固時間、pH值、釋氧曲線的檢測，我們認為10%濃度的增氧劑材料具有較好的理化特征和更好的釋氧性能。掃描電鏡結果顯示：材料為無定向的網狀結構，結構廣泛存在的微孔結構便于種子細胞、細胞因子和藥物成分的附著和分布，有利于組織間氧氣、營養物質和代謝產物的交換和運輸，也有利于新生血管的長入。細胞毒性及生物相容性實驗顯示，該材料無細胞毒性，生物相容性良好，在體內可被完全降解。因此，我們認為，將富氧劑復合入骨組織工程材料中，可以有效改善移植物早期的細胞代謝微環境，可能會進一步促進支架內功能性種子細胞和血管內皮細胞的存活和分化，從而最大化骨組織工程材料修復骨缺損效能的發揮[26]。

綜上所述，本實驗篩選并制備的1-溴十七氟辛烷濃度為10%的富氧溫控型骨組織工程材料無毒無害，具有良好的理化特性、釋氧性能、生物相容性和可降解性。這種新型富氧溫控型骨組織工程材料在骨缺損治療的研究中具有良好的應用前景。