姜黃素抑制腎癌A498細胞增殖及其機制研究

董曉丹，穆素紅

腎細胞癌占成人腎臟原發性惡性腫瘤的90%，腎細胞癌早期患者通常沒有明顯的臨床癥狀，當患者確診為腎細胞癌時通常已經發展至晚期[1-4]。因此，尋找一種療效好、不良反應小、安全性高的治療藥物迫在眉睫。姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的一種天然二酮類化合物，具有抗腫瘤活性，在肝癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等實體腫瘤的細胞學研究中，被證實具有抑制腫瘤轉移、腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡，以及增敏抗癌藥物活性[5-6]。本研究旨在研究姜黃素對體外培養的腎癌A498細胞增殖和凋亡的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 人腎癌A498細胞(中國醫學科學院細胞中心)，姜黃素(sigma公司，純度97%，用無水乙醇溶解)，二甲基亞砜、胎牛血清(杭州四季青公司)、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，Hoechst-PI雙染試劑盒(南京建成生物研究所)，BCA蛋白測定試劑盒、PVDF膜及化學發光試劑(上海碧云天公司)，p53、p21及GAPDH抗體(上海碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養:在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養腎癌A498細胞，青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml，培養箱內溫度為37℃，CO2體積分數為5%，每3天傳代1次，更換新鮮培養液，取對數期生長的細胞進行實驗，細胞密度達到80%左右，用胰酶消化進行實驗。

1.2.2腎癌A498細胞分組：細胞接種于96孔板，分4組，每組5個復孔。對照組以正常培養液培養24 h。姜黃素組依姜黃素濃度不同分為10、20、40 μmol/L組，培養48 h后進行后續實驗。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖情況:腎癌A498細胞接種于96孔板中，每孔200 μl細胞密度為1×105/ml，棄去原有培養液，將已配置含10% CCK-8的培養基以換液的形式加入，接種后的96孔板37℃培養箱中培養4 h，觀察細胞已貼壁。檢測480 nm吸光度。

1.2.4細胞凋亡的形態學觀察:我們采用Hoechst-PI染色法定量觀察細胞凋亡情況，細胞接種于6孔板中，調整細胞密度至3×105/ml，按照試劑盒說明，更換細胞培養液并用PBS沖洗3遍，在150 μl的Binding Buffer中分別加入Hoechst(5 μl)及PI(2 μl)混勻，室溫避光反應5 min，熒光顯微鏡下觀察、拍照并統計分析凋亡細胞比例。

1.2.5細胞超微結構變化：室溫下1%鋨酸固定細胞2 h，丙酮脫水，常規電鏡包埋，制作超薄切片，枸櫞酸鉛和2%醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡觀察。

1.2.6蛋白免疫印跡試驗檢測腎癌A498細胞內p53及p21蛋白表達：提取蛋白質后以Brandford法測定每個樣品蛋白濃度。加入上樣緩沖液，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%脫脂奶粉4℃封閉2 h，加一抗(稀釋濃度1∶1000)過夜，室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2000)1 h，ECL化學發光法自顯影并采集圖像，利用樣本目的蛋白光密度比內參條帶光密度，比較不同樣本相對表達率。

2 結果

2.1細胞增殖情況 隨姜黃素作用濃度增加，腎癌A498細胞增殖率逐漸降低，10、20及40 μmol/L姜黃素作用于腎癌A498細胞48 h后，細胞增殖率分別為(72.00±3.61)%、(57.43±3.61)%和(34.67±3.61)%，對照組為(95.33±53.44)%。姜黃素10、20及40 μmol/L組腎癌A498細胞增殖率低于對照組，且姜黃素不同濃度組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 MTT法檢測姜黃素對腎癌A498細胞增殖率的影響

10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理；與對照組比較，bP<0.01；與10 μmol/L組比較，dP<0.01；與20 μmol/L組比較，fP<0.01

2.2姜黃素對腎癌A498細胞凋亡的影響 熒光顯微鏡下，對照組背景熒光暗黑色，可見數個散在凋亡細胞核(亮藍色強熒光)，細胞凋亡率為(2.33±1.87)%；10、20及40 μmol/L姜黃素作用于腎癌A498細胞后凋亡細胞數量增多，甚至出現紅染的壞死細胞，細胞凋亡率分別為(19.00±3.74)%、(34.67±3.38)%、(75.67±5.44)%，均高于對照組，且姜黃素不同濃度組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2、3。

2.3姜黃素對腎癌A498細胞超微結構變化的影響 對照組細胞形態規則，核仁類圓形，染色質正常，胞質內粗面內質網結構正常，線粒體峭可見。10 μmol/L姜黃素作用腎癌A498細胞48 h后，細胞膜邊緣部分膨出，細胞核內染色邊集，伴隨姜黃素作用濃度增加，部分細胞內可見凋亡小體，細胞核染色質濃縮，粗面內質網及線粒體形態不清晰。見圖4。

圖2 4組腎癌A498細胞凋亡情況(×200)
10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理

圖3 姜黃素對腎癌A498細胞凋亡的影響

10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理；與對照組比較，bP<0.01；與10 μmol/L組比較，dP<0.01；與20 μmol/L組比較，fP<0.01

2.4姜黃素對p53及p21蛋白表達影響 10、20及40 μmol/L姜黃素作用于腎癌A498細胞48 h后，p53蛋白相對表達量分別為(40.29±2.09)%、(99.46±6.73)%、(133.43±13.50)%，對照組為(32.53±1.87)%。姜黃素10、20及40 μmol/L組p53蛋白相對表達量較對照組升高，且不同濃度姜黃素組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。10、20及40 μmol/L姜黃素作用于腎癌A498細胞48 h后，p21蛋白相對表達量分別為(49.77±3.70)%、(95.93±6.13)%、(133.10±7.92)%，對照組為(23.12±4.52)%)。姜黃素10、20及40 μmol/L組p21蛋白相對表達量較對照組升高，且不同濃度姜黃素組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5、6。

圖4 姜黃素對腎癌A498細胞超微結構變化的影響(×5000)
10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理

圖5 4組腎癌A498細胞內p53及p21蛋白表達情況
10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理

圖6 姜黃素對腎癌A498細胞內p53及p21蛋白表達影響

10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理；與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與10 μmol/L組比較，cP<0.05，dP<0.01；與20 μmol/L組比較，eP<0.05，fP<0.01

3 討論

腎細胞癌首選手術治療，但由于惡性腫瘤具有侵襲性生長，增殖較快，與周圍正常組織間無明顯界限的特點，手術過程中難以徹底切除，因此，化療及靶向治療在腎細胞癌治療中逐漸發揮重要作用[7-9]。治療腎細胞癌化療藥物種類較多，其在促進腫瘤細胞凋亡的同時，也抑制了人體正常細胞的生長代謝，使免疫系統遭到破壞[10-11]。化療藥物均有不同程度的毒副作用，因此，選擇一種低毒、安全的化療藥物對腎細胞癌患者預后至關重要[12-13]。

姜黃素是廣泛存在于多種中草藥中的二酮類化合物，對多種人腫瘤細胞有不同程度抑制作用，姜黃素通過增加線粒體膜通透性、促進腫瘤細胞凋亡發揮抗癌作用，對鼻咽癌細胞系、乳腺癌細胞系、急性髓性白血病細胞系和肝癌細胞系均有抑制作用[14-17]。姜黃素具有低毒、價格低廉的特點，具有廣闊的研究和應用前景[18-20]。近年來，有學者將姜黃素應用于人腎癌Caki-2細胞，顯示了姜黃素通過抑制H-Ras蛋白表達、直接或間接下調ERK信號通路蛋白表達，從而誘導Caki-2細胞凋亡[21]。

CCK-8法主要用于細胞毒性及細胞增殖率的檢測。本研究結果顯示，姜黃素對人腎癌A498細胞生長具有抑制作用，腎癌細胞增殖率隨姜黃素濃度的增加而降低，呈一定的劑量依賴性。為了驗證姜黃素對腎癌細胞A498凋亡的促進作用，我們采用Hoechst PI核染色法觀察細胞凋亡情況，正常細胞核的Hoechst著色呈淡藍色，凋亡早期及中期細胞核由于核染色質濃集呈亮藍色，可見核邊集或碎片，處于凋亡晚期或壞死期的細胞核可被PI染料著色，熒光顯微鏡下呈紅色。本研究結果顯示，姜黃素干預腎癌A498細胞后，凋亡及壞死細胞明顯增多，證實姜黃素可以劑量依賴性促進腎癌A498細胞凋亡。

研究指出，姜黃素可以激活凋亡前體蛋白p53和其下游效應物p21抑制乳腺癌細胞系MCF-7細胞的增殖[22]。為了進一步明確姜黃素抑制腎癌A498細胞活性的具體機制，我們檢測了細胞內凋亡前體蛋白p53和其下游效應物p21的蛋白表達情況。蛋白免疫印跡結果顯示，姜黃素能激活p53表達，上調p21蛋白表達水平。

綜上所述，本研究結果為臨床應用姜黃素治療腎癌提供了理論及實驗依據，但治療效果以及藥物治療濃度仍待大規模臨床試驗進一步證明。