MMP-14、Endoglin和sEng在子癇前期患者中表達的意義及相關性分析

季燕雯，陳先俠

子癇前期是一種妊娠特異性疾病，主要表現為新發高血壓和蛋白尿，是嚴重危害母胎健康的主要原因，其全球發病率為5%～8%[1]。目前子癇前期的發病機制不明，可溶性內皮糖蛋白(sEng)升高在子癇前期內皮損傷機制中占主導地位，且作為子癇前期預測因子較為明確，但對其升高機制研究尚不明確[2]。近年來,在腫瘤研究中發現基質金屬蛋白酶-14(MMP-14)可能起到調控sEng釋放的作用，因此本研究通過研究子癇前期患者胎盤中MMP-14、內皮糖蛋白(Endoglin)和血清sEng的表達及相關性，進一步探討MMP-14、Endoglin和sEng在子癇前期發病機制中的意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2018年9月—2019年1月婦幼保健院分娩孕產婦血清及胎盤，早發型子癇前期20例為A組,晚發型子癇前期24例為B組，以同期擇期行剖宮產的正常妊娠晚期產婦20例為C組。診斷參考《婦產科學》第九版，孕34周之前發病為早發型子癇前期，34周之后發病為晚發型子癇前期。納入標準：單胎、孕婦年齡20～40歲；患者及其家屬簽署知情同意書；排除標準：孕前及孕期未合并內外科疾病。研究符合倫理學標準，經本院倫理學委員會審核批準。3組年齡、身高、體重、孕產次比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 3組孕婦一般資料比較

注：A組為早發型子癇前期患者,B組為晚發型子癇前期患者，C組為行剖宮產的正常妊娠晚期產婦

1.2儀器與試劑 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測采用雷杜RT-6500酶標分析儀；人sEng(ENG/sCD105)ELISA檢測試劑盒購于上海源葉生物科技有限公司，兔單抗Anti-MMP-14抗體[EP1264Y](ab51074)、鼠抗人Endoglin單克隆抗體均購于艾博抗(上海)貿易有限公司。

1.3標本采集和實驗方法

1.3.1標本采集：術前晨于空腹靜息狀態下抽取肘靜脈血3 ml，靜置30 min后立即離心(3000 r/min)10 min,分離血清,置于-80℃集中保存待測。所有孕婦均在分娩時取胎盤中央全層1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm組織塊，包埋制作蠟塊保存待測。

1.3.2實驗方法

1.3.2.1胎盤中MMP-14和Endoglin水平：采用免疫組化法半定量檢測。具體方法：烤片，組織切片脫蠟，細胞通透、封閉內源性過氧化物酶，抗原修復、暴露抗原決定簇，封閉非特異性蛋白，一抗孵育，二抗孵育，SP反應，顯色，復染、脫水、透明、封片。利用Nikon 4500 顯微鏡攝片。MMP-14表達陽性結果為細胞質或胞核染色成棕黃色，Endoglin表達陽性結果為細胞膜染色為黃色或棕黃色，每張切片隨機選取5個×200倍視野，計數陽性染色細胞數，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算光密度值。

1.3.2.2血清sEng水平：采用ELISA定量檢測，先將sEng和生物素標記的抗體同時溫育，洗滌后加入親和素標記過的HRP，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，與酶結合物同時作用產生顏色，顏色的深淺和樣品中sEng的濃度呈比例關系，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

2 結果

2.1胎盤中MMP-14、Endoglin與血清中sEng的表達情況 A、B組MMP-14、Endoglin和sEng表達水平高于C組，且A組高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。3組胎盤組織MMP-14陽性表達情況見圖1。

表2 3組孕婦胎盤中MMP-14、Endoglin與血清中sEng含量比較

注：A組為早發型子癇前期患者,B組為晚發型子癇前期患者，C組為行剖宮產的正常妊娠晚期產婦;MMP-14為基質金屬蛋白酶-14，Endoglin為內皮糖蛋白，sEng為血清可溶性內皮糖蛋白；與C組比較，bP<0.01；與B組比較,dP<0.01

圖1 3組胎盤組織MMP-14陽性表達情況(SP×200)

A組為早發型子癇前期患者,B組為晚發型子癇前期患者，C組為行剖宮產的正常妊娠晚期產婦；MMP-14為基質金屬蛋白酶-14

2.2MMP-14與Endoglin、sEng相關性分析 A、B組患者胎盤組織中MMP-14水平與血清中sEng、Endoglin水平呈正相關(r=0.941、0.776、0.770、0.279，P<0.01)。

2.3早發型子癇前期MMP-14與Endoglin、sEng的表達情況 早發型子癇前期發病孕周<28周、28～30周(不包括30周)、30～32周(不包括32周)各4例，32～34周(不包括34周)8例，發病孕周越早，胎盤中MMP-14、Endoglin水平與血清中sEng越高，差異有統計學意義(P<0.01)，但28～30周和30～32周比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 早發型子癇前期孕婦不同孕周胎盤中MMP-14、Endoglin與血清中sEng表達情況

注：MMP-14為基質金屬蛋白酶-14，Endoglin為內皮糖蛋白，sEng為血清中可溶性內皮糖蛋白；與28～30周比較，bP<0.01；與30～32周比較，dP<0.01；與32～34周比較，fP<0.01

3 討論

妊娠高血壓綜合征是一種嚴重危害母嬰健康的妊娠并發癥，早發型子癇前期占妊娠高血壓綜合征的0.9%，及時終止妊娠可終止疾病進展，但可能增加醫源性早產和新生兒死亡率[3-4]。血管內皮細胞損傷、內皮功能激活、失調和結構損害是子癇前期病理生理改變的一個重要環節，改善內皮細胞功能可有效延緩疾病發生與發展。

sEng是由胎盤產生的內皮損傷性因子，與子癇前期發病密切相關。sEng可影響轉化因子β的正常信號轉導通路，引起轉化因子受體復合物1與血管內皮細胞表面轉化因子β受體Ⅱ無法順利連接，從而導致轉化生長因子β1(TGF-β1)的信號最終無法順利傳遞到細胞內，阻礙滋養層細胞侵襲和遷移，最終致血管形成不良以及血管通透性增加導致血管內皮損傷[5]。Stepan等[6]研究表明，孕13～28周血清sEng升高往往預示著不良妊娠結局。因此，sEng參與疾病的發生發展，但其分子機制尚未明確[7-8]。

MMP-14作為基質金屬蛋白酶(MMPs)家族中的一種類型，在多種惡性腫瘤組織中過表達，且與腫瘤浸潤、轉移相關[9]。目前MMPs是藥物設計具有吸引力的靶標，并且長達30年一直是抑制劑設計的焦點[10]。MMP-14可作為結直腸癌和乳腺癌中Endoglin的裂解蛋白酶，其主要機制為上皮TGF-β1的過量表達通過旁路方式產生水解基質蛋白前肽的信號，使原先以酶原形式存在的MMP-14具有活性，刺激上皮Endoglin的脫落，從而產生sEng促進腫瘤新生血管的形成及轉移[11-12]。有學者認為胎盤組織以“偽腫瘤”的狀態存在于孕婦體內[13]，氧化應激可能通過激活p38MAPK信號轉導誘導Gadd45α過度表達影響MMPs的活性，以影響滋養層細胞的侵襲，并增加sEng的分泌，參與子癇前期的發病機制[14]。

關于MMP-14與sEng在妊娠婦女中的研究相對較少，對于MMP-14與sEng之間的相互關系處于在研階段。Kaitu'u-Lino等[15]研究發現在合胞體化的BeWo細胞施用廣譜MMPs抑制劑(GM6001)，特異性阻止MMP-14和Endoglin之間的相互作用，可有效降低sEng表達水平。Zhang等[16]研究發現，重度子癇前期患者的胎盤中MMP-14、Endoglin和血清sEng表達水平顯著增加，MMP-14和Endoglin表現出共表達，共同定位在合體滋養細胞中；在其研究中發現在胎盤的母體-胎兒橫截面，MMP-14可能作為切割蛋白酶切割Endoglin，然后將其細胞外結構域釋放到母體循環中形成sEng。本研究結果顯示，早發型子癇前期患者胎盤中MMP-14、Endoglin與血清sEng水平高于晚發型子癇前期及正常患者，對于早發型子癇前期的發病孕周進行觀察發現，胎盤中MMP-14、Endoglin與血清sEng表達水平與發病早晚有明顯相關性，發病越早，MMP-14、Endoglin與sEng的表達水平越高，但在孕28～32周時無明顯差異，提示在孕28周以及32周是早發型子癇前期治療的重要節點，這與許多學者認為早發型子癇前期以孕32周為界的觀點相一致[17]。而胎盤Endoglin表達上調可能是由于代償機制，即子癇前期胎盤滋養層浸潤過淺，導致胎盤形成不良、缺血，Endoglin過表達促進TGF-β,并促進滋養層入侵和遷移補償胎盤滋養層缺血。本研究顯示，MMP-14、Endoglin與sEng的表達均存在正相關，且子癇前期患者中存在MMP-14過表達，提示MMP-14可調節sEng的高表達而來參與子癇前期進一步發展[18-19]。

子癇前期的防治一直是臨床工作的重點與難點。高危人群中使用母血清sEng可作為子癇前期診斷的早期標志物，Hawinkels等[20]提出通過抑制MMP-14的表達阻止sEng升高可改善重度子癇前期臨床癥狀，可能會從胎盤源性方向尋找該病的治療方案。本研究結果顯示，早發型子癇前期患者胎盤中MMP-14水平明顯升高，胎盤中Endoglin也高于正常組，同時血清中sEng也隨之升高，表明子癇前期患者胎盤中存在MMP-14和Endoglin的過表達，可調節sEng的升高，晚發型子癇前期患者也表現出這種關系。因此在臨床研究中可通過抑制MMP-14的產生降低sEng的表達，為臨床診治子癇前期尤其是早發型子癇前期提供一種新的診療思路。

綜上所述，MMP-14、Endoglin與sEng均在子癇前期患者中高表達，三者共同參與子癇前期的發生、發展，MMP-14可作為重要的調節因子，調節sEng的高表達，因此選擇合適的方案進行干預可能有助于子癇前期的防治。MMP-14、Endoglin與sEng在子癇前期中的進一步關系應在動物模型中開展相關實驗，以提高臨床應用價值。