分子病理學技術在非小細胞肺癌診療中的應用

(青島大學附屬醫院病理科，山東 青島 266555)

病理學是介于臨床與基礎醫學之間的橋梁學科，被喻為疾病最后診斷的“金標準”。病理學發展大體歷經三個階段：器官病理學、細胞病理學、分子病理學。隨著分子生物學技術的發展以及分子生物學技術與傳統病理學的融合，病理學發生了革命性的進步，進行了重新的整合，步入病理學的第三個階段——分子病理學。分子病理學是病理學和多個學科相結合形成的一門新的分支學科，主要是從核酸和蛋白質等生物大分子水平研究疾病發生發展的機制，為疾病的診療提供依據[1]。

肺癌是全球發病率和致死率最高的腫瘤之一，非小細胞肺癌(NSCLC)是臨床上最常見的類型，約占全部肺癌的85%。我國NSCLC的發病率大約為53.57/100 000，男性略高于女性[2]。晚期NSCLC 患者的傳統治療以第三代化療藥聯合鉑類藥物化療為主，但療效已達平臺期，中位總生存期(OS)約為8個月，2年生存率約為12%，患者很難再從中進一步獲益[3]。分子病理學技術的發展，使NSCLC疾病發生發展機制的研究更深入和精細，使精準治療成為可能，從而顯著延長了患者的生存時間，提升了患者的生存質量。

目前與NSCLC診療相關的分子病理學技術包括免疫組織化學(IHC)技術、原位雜交(ISH)技術、聚合酶鏈反應(PCR)相關技術及生物芯片技術等。

1 IHC技術

1941年COONS[4]創立了細胞化學中的“免疫細胞化學”，使用熒光素標記的抗體成功檢測到肺組織內的肺炎雙球菌。經過幾十年的不斷發展，從最初的直接免疫熒光標記方法，逐漸發展為免疫熒光組織化學技術、免疫酶組織化學技術、親和免疫組織化學技術和免疫金-銀組織化學技術等。

IHC利用抗原與抗體特異性結合的原理，首先通過抗體識別組織細胞內的抗原(多肽和蛋白質)，然后再通過化學反應使抗體上標記的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，最終對組織細胞內的抗原進行定位、定性及定量研究。該方法具有特異度及靈敏度高、定位準確、形態學與功能學相結合等優點，目前越來越多地用于臨床病理診斷、腫瘤良惡性和轉移瘤來源判斷、預后評估及基礎科學研究。在分子病理學技術中，IHC技術是評估蛋白質表達水平最簡單、最實用的方法，不僅能進行半定量檢測、細胞內定位，還能對蛋白質翻譯后修飾情況(如蛋白質磷酸化等)進行檢測。

在NSCLC中，IHC檢測主要用來進行輔助診斷。對于形態學上不能明確的NSCLC手術樣本，一般會用TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6、P63對肺腺癌、肺鱗癌進行鑒別診斷[5-7]；對于晚期NSCLC的活檢樣本，也要盡可能地使用TTF-1、P40兩個IHC指標對肺腺癌、肺鱗癌進行鑒別診斷[6-7]。除此之外，還可以利用IHC技術對NSCLC和其他的腫瘤進行鑒別診斷，比如神經內分泌癌、惡性間皮瘤等[7-9]。對于NSCLC來說，IHC檢測除了可作為一種鑒別診斷的手段外，還可為靶向用藥提供依據。中國臨床腫瘤學會(CSCO)原發性肺癌診療指南中推薦可以通過Ventana免疫組化檢測ALK融合來指導ALK抑制劑的應用。此外，還可以采用兔抗人EGFR L858R單克隆抗體和兔抗人EGFR E746-A750單克隆抗體檢測NSCLC樣本中的EGFR基因L858R和E746-A750del的突變狀態，與熒光定量PCR法相比，兩種方法對基因突變狀態的檢測具有較高一致性，因此對于沒有條件進行PCR檢測的醫院，可以通過此種方法判斷NSCLC患者能否進行酪氨酸激酶抑制劑治療[10-11]。

2 ISH技術

ISH技術利用堿基配對的原理，首先使標記了標記物的核酸探針與組織細胞內的待測核酸雜交，然后再通過一系列的組織化學或者IHC方法使探針上的標記物顯色，對待測核酸進行細胞內定位。ISH主要分為：基因組原位雜交(GISH)、熒光原位雜交(FISH)、多彩色熒光原位雜交(M-FISH)和原位PCR。除此之外，根據探針標記物的不同還可分為FISH、顯色原位雜交(CISH)以及銀染原位雜交(SISH)。

在NSCLC中，可以利用FISH來檢測某個基因的拷貝數增多和結構變異情況。對于NSCLC的ALK基因的結構變異檢測，FISH被認為是ALK檢測的金標準，經常用于其他ALK檢測方法的驗證[12]。美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)肺癌診療指南推薦使用FISH技術進行ALK、ROS1、RET基因重排和MET基因擴增的檢測。此外，M-FISH還被用于肺癌的早期診斷。腫瘤的發生發展多伴有遺傳學改變，在許多實體腫瘤(包括肺癌)中經常能見到染色體數目變異(尤其是非整倍體)。因此，可以通過染色體數目變異檢測實現對肺癌的早期診斷及肺癌與肺良性病變的鑒別診斷[13]。

3 PCR相關技術

PCR技術可以模擬體內DNA的天然復制過程，大量擴增微量DNA。PCR技術誕生不足40年的時間里得到了突飛猛進的發展，并衍生出了一系列的相關技術，如第一代測序、實時熒光定量PCR(qPCR)、數字PCR (dPCR)、第二代測序(NGS)技術等，這些技術在NSCLC的分子病理檢測中發揮著重要作用。

3.1 第一代測序技術

第一代測序技術的萌芽早于PCR技術的發明。成熟的第一代測序技術主要包括化學降解法和雙脫氧鏈終止法。目前應用最廣泛的美國應用生物系統公司(ABI)3730系列自動測序儀利用的測序技術就是雙脫氧鏈終止法，同時使用了毛細管電泳和熒光標記技術。第一代測序技術的出現使人類獲得了探索生命遺傳信息的能力。人類基因組計劃(HGP)正是利用這種技術，成功完成了人類基因組30億個堿基對的測序和人類基因圖譜繪制，發現了大量腫瘤相關基因以及藥物靶基因，極大地推動了生命科學的研究進展[14]。美國重大科研項目——“癌癥基因組圖集”(TCGA)計劃極大的豐富了NSCLC的基因圖譜。Sanger測序法作為最經典的第一代測序技術，具有測序讀長長、準確性高的特點，是最早應用于EGFR基因檢測的一種技術，主要進行EGFR18～21四個外顯子的測序，可以檢測待測區域內的所有變異類型，尤其是一些稀有變異和未知變異，被當作是EGFR檢測的金標準[15]。目前NSCLC相關的靶基因多達十幾個，臨床上需求更多的是進行多基因共檢而不是單個基因的檢測，因此Sanger測序已經不能很好地滿足NSCLC基因檢測的需求。但是，作為基因序列測定的金標準，Sanger測序經常會用于qPCR、普通PCR、NGS等方法的基因突變檢測結果的驗證。

3.2 qPCR技術

根據熒光標記方法的不同，qPCR技術可以分為熒光染料法以及熒光探針法。前者主要有Pico Green染料法和SYBR Green染料法，后者主要有水解探針法以及分子信標法等。水解探針法中應用最廣泛的是TapMan探針法，即在PCR反應體系中加入了一個特異的熒光標記探針。分子信標法目前應用最多的是Scorpions突變阻滯擴增系統PCR(ARMS-PCR)法。ARMS技術主要是在引物序列的3′端人為添加錯配堿基，增加擴增特異性，用于基因突變檢測。TapMan探針法或ARMS技術均可以檢測已知基因的突變，但相比較而言，ARMS檢測方法具有更高的靈敏度以及特異度[16-18]。目前ARMS-PCR技術廣泛地應用于NSCLC的EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS、NRAS等基因的檢測，但是ARMS技術具有一定的局限性，只能檢測已知基因變異，不能進行高通量檢測，不能檢測未知變異，同時對某些稀有變異和拷貝數變異也會出現漏檢。另外，標本類型、腫瘤細胞含量、DNA濃度和質量、加樣誤差及氣溶膠污染等問題也會影響ARMS檢測結果的穩定性。

3.3 dPCR技術

dPCR的基本原理是“分而治之”。首先把樣本分成很多份，少則幾十份，多則幾萬份，然后平均分配到各個反應單元中，每個反應單元中的待測核酸數量符合泊松分布，包含零個到多個待測核酸，理想狀態下為1個。待測核酸在每個反應單元中獨立地進行PCR擴增。擴增結束后，對每個反應單元的熒光信號進行檢測，根據泊松分布和熒光信號陽性的反應單元占比來計算待測核酸序列的拷貝數。在dPCR反應中熒光信號的產生過程基本與qPCR相同。dPCR主要分為微反應室/孔板dPCR、微流控芯片dPCR(cdPCR)以及微滴dPCR(ddPCR)三大類dPCR。后兩種則是目前主要的商業化的dPCR技術。ddPCR技術以美國Bio-Rad公司的QX200系統以及美國Raindance Technogies公司的RainDrop為代表。cdPCR技術以美國Fluidigm公司的BioMark HD系統以及美國Life Techonolgy公司的QuantStudio 3D系統為代表。

dPCR具有高靈敏度、高精確性、高耐受性和絕對定量的優點，因此特別適合用于稀有基因變異檢測、拷貝數變異分析和復雜樣本基因表達研究等。對于NSCLC獲得性耐藥患者的循環腫瘤DNA的T790M突變情況的檢測，ddPCR方法的檢出率要明顯高于ARMS技術[19]，因此ddPCR技術特別適合于對NSCLC患者用藥后的動態監測。

3.4 NGS

NGS又稱為高通量測序，其具備Sanger檢測技術所沒有的高性能——高通量、快速、高準確性以及低成本等優點。NGS主要包括有全基因組測序(WGS)、全外顯子組測序(WES)以及目標區域測序(TRS)。與傳統檢測方法相比較，WGS可以在全基因組水平上檢測基因變異，涉及人類所有基因，能及時發現未知變異，更好地完善NSCLC相關基因圖譜。SHAO等[20]利用Ion Torrent平臺進行靶向下一代測序，在 58例臨床病例中發現了與肺腺癌相關的突變譜。但是臨床上對于NSCLC患者選擇靶向用藥或者預后預測方面，用的更多的是TRS技術，這主要是因為NSCLC的基因變異主要集中在EGFR、ALK、ROS1、RAS、BRAF、RET、HER-2等基因上，而且部分基因還存在熱點突變，比如EGFR的熱點突變主要集中在19～21外顯子區域。除此之外，NGS技術還可以用于腫瘤組織突變負荷(TMB)檢測，用于預測NSCLC患者能否從免疫治療中獲益。據相關文獻報道，TMB高的患者，與單純的化療相比，免疫治療可以明顯地提高無進展生存期(PFS)和OS[21-22]。

4 生物芯片技術

生物芯片技術是指采用原位合成法或點樣法等方法，將組織、細胞或核酸、蛋白質、糖類等生物大分子固定于固相載體上構成高密度微陣列，通過相應的檢測系統實現對生物樣品的分析，具有快速高效、高并行性、高通量、微型化、自動化以及成本低等優點[23]。生物芯片主要有基因芯片、蛋白質芯片和組織芯片等。美國Affymatrix公司研發的基因芯片標志著生物芯片的誕生?；蛐酒夹g是分子生物學與計算機技術、高分子化學合成技術、微電子技術等多學科相互結合形成的一門新型生物學技術，可用于基因表達圖譜的繪制，探索疾病發生發展的機制、發現診療相關的靶基因，闡述基因功能，輔助蛋白組計劃的實施。此外，基因芯片還可以用于檢測基因多態性及基因變異。蛋白質芯片是研究蛋白質組學的有力工具，主要有蛋白質檢測芯片和蛋白質功能芯片兩大類。在臨床醫學研究中,研究者經常利用蛋白質芯片技術尋找新的腫瘤標志物用于腫瘤早期的診斷和預后評估，如WANG等[24]利用C-12多腫瘤蛋白質芯片檢測系統對224例肺癌患者、159例肺良性病變的患者以及90例健康者進行了血清CA125、CA19-9、鐵蛋白、CA15-3、CA242、CEA、AFP、NSE、PSA、f-PSA、HGH、β-HGH的檢測，發現肺癌組織C-12的陽性率為77.23%,高于肺良性病變的組織(13.84%)和健康對照組織(9.76%)。除此之外，蛋白質芯片也可以用于對NSCLC發病機制的研究，如VANMETER等[25]利用反向蛋白質芯片技術研究EGFR突變以及其磷酸化引起NSCLC發病的具體信號機制，發現EGFR突變患者的細胞群體中EGFR Tyr-1148以及Tyr-1068同時上調，而HER2 Tyr-1248和EGFR Tyr-1045同時下調，認為細胞癌變可能與以上因素引起的PI3K/AKT/mTOR等信號通路持續激活、EGFR泛素化速率和轉化抑制能力降低有關。組織芯片結合了分子生物學和組織形態學的優勢，主要用于各類原位組織技術實驗，結合IHC、ISH、原位PCR等技術，可以針對細胞、核酸以及蛋白質等進行形態學與功能學的研究[26-27]。在NSCLC研究方面,組織芯片技術主要用于疾病的病因學研究、診斷、鑒別診斷、治療和預后評估, 同時通過這一技術還可進一步發現與肺癌相關的特異性基因表達產物和免疫標記物。

隨著醫學和分子生物學的發展，越來越多的分子病理學技術應用于NSCLC的診療中，為NSCLC患者提供靶向治療和免疫治療的依據，從而極大地延長了患者的OS和PFS。但是由于受到技術、成本的限制以及試劑、樣本局限性等的影響，某些分子病理學技術(如NGS、生物芯片技術等)在醫院病理科的開展受到一定的限制，因此后續應該致力于優化技術、簡化實驗流程、降低成本，使更多的分子病理學技術能應用于臨床診療，真正地服務于臨床、服務于患者。