PRRX1對乳腺癌多藥耐藥發生的影響及其機制

(青島大學附屬醫院乳腺病診療中心，山東 青島 266003)

乳腺癌是目前發病率較高的腫瘤之一[1]。在乳腺癌的綜合治療中，化療占有十分重要的地位。但多藥耐藥(MDR)即癌細胞同時對不同藥物產生交叉耐藥性仍然是化療成功的主要障礙[2]。在MDR的眾多原因中，由MDR1編碼的P-糖蛋白(P-gp)過表達發揮著重要作用，可在藥物到達細胞內靶點前即被攔截和排出胞外[3]。P-gp的過表達也會使乳腺癌細胞對治療中的許多常用藥物產生耐藥性，如蒽環類、紫杉類、長春堿類藥物等[4]。因此，逆轉MDR、提高患者的化療療效成為乳腺癌治療中最大的挑戰之一。上皮-間質轉化(EMT)是指上皮細胞轉化為間質細胞的過程。發生EMT的細胞失去極性，細胞間連接松散，并伴隨EMT標記物如N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(vimentin)表達的改變[5]，導致腫瘤細胞的遷移和侵襲能力增強，這是

腫瘤細胞發生轉移的潛在機制[6]。配對相關同源框1(PRRX1)已被證實為一個新的EMT的誘導因子，可使乳腺癌[7]、大腸癌[8]、胰腺癌[9]、胃癌[10]和頭頸癌[11]等腫瘤細胞發生EMT。其過表達可以增強乳腺癌細胞的遷移性和侵襲性[12]，但其在乳腺癌MDR中的作用鮮有報道。本研究旨在探討EMT誘導因子PRRX1在乳腺癌MDR中的作用及其分子機制，并為乳腺癌治療和預防提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞分組及瞬時轉染

乳腺癌細胞MCF-7購自中國科學院上海細胞研究所，將細胞接種于含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基(美國HyClone公司)并置于37 ℃含體積分數0.05的CO2的恒溫培養箱中培養。當細胞融合達80%以后分離接種于24孔板中，細胞按照處理方法不同分為3組，未處理的MCF-7細胞作為空白對照組(A組)，轉染空白pEX-3載體(上海吉瑪制藥技術有限公司)的MCF-7細胞作為陰性對照組(B組)，轉染攜帶PRRX1基因的重組質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司)的MCF-7細胞作為實驗組(C組)。B、C組細胞于轉染前1 d更換培養基，使用Lipofecta-mine 2000(美國Iivitrogen公司)試劑進行轉染。轉染48 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態及轉染情況。收集3組細胞(約9×105個/孔)用于后續相關基因和蛋白分析測定。

1.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測各組細胞當中PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gp mRNA的表達

從3組MCF-7細胞中提取總RNA并反轉錄成cDNA。然后采用Gene Amp 2400 PCR儀(美國PE公司)進行RT-qPCR。RT-qPCR的反應條件為：95 ℃預變性30 s；然后98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共進行40個循環；最后95 ℃延伸1 min。以β-Actin作為內參基因，使用2-△△CT方法計算各組細胞中PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gpmRNA的相對表達量。引物序列見表1。

1.3 WES蛋白質印跡定量分析系統檢測各組細胞PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gp蛋白的表達

以蛋白裂解液提取各組細胞的總蛋白以后，用BCA法測定蛋白濃度。將不同組別蛋白質溶液調成相同濃度。依照說明書將Ladder加入WES試劑盒檢測板第一行第1孔，其余24孔依次循環加入3組等濃度蛋白質溶液，第2行加入抗體稀釋液，第3行加入β-Actin、PRRX1、N-cadherin、Vimentin及P-gp一抗，第4行加入與各一抗對應的二抗，第5行加入發光液，最后加入緩沖液。離心并上機操作，運行完成后采用Compass軟件分析目標蛋白的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列和產物長度

1.4 CCK-8檢測細胞半數抑制濃度(IC50)

取對數生長期的3組MCF-7細胞(4 000個/孔)接種于96孔板中。細胞貼壁后加入化療藥物多西他賽和順鉑(北京索萊寶科技有限公司)。多西他賽的最終濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 μmol/L，順鉑的最終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 μmol/L。每個濃度設3個復孔，未加藥的孔作為對照孔，加不含細胞的完全培養基的孔為調零孔。加入藥物24 h后，每孔添加CCK-8試劑10 μL混合后，再放回培養箱孵育1 h，采用酶標儀于波長450 nm處測量各孔吸光度值。用GraphPad Prism 6軟件計算各組細胞的IC50。

1.5 統計分析

2 結 果

2.1 各組細胞的轉染情況

倒置熒光顯微鏡下觀察顯示，A組未見熒光(圖1A)，B組和C組均可見綠色熒光(圖1B、C)，轉染效率約為80%。A組和B組的細胞間均連接緊密，呈“鋪路石”狀(圖1D、E)，而C組細胞間連接松散，呈“紡錘形”(圖1F)。

2.2 各組細胞中PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gp mRNA及蛋白表達情況

3組細胞中的PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gpmRNA及蛋白表達水平比較差異均具有顯著性(F=7.08～23.39，P<0.05)。其中C組上述4種因子的 mRNA及蛋白表達水平均明顯高于A、B兩組(t=3.02～10.92，P<0.05)，A、B兩組比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.3 各組細胞多西他賽和順鉑處理后的IC50

多西他賽對A、B、C組細胞的IC50分別為0.45±0.06、0.44±0.06、1.29±0.14，順鉑對A、B、C組細胞的IC50分別為0.60±0.07、0.59±0.11、1.73±0.23，兩種藥物對3組細胞的IC50比較差異均具有顯著性(F=26.84、7.081，P<0.01)；其中兩種藥物對C組細胞的IC50明顯高于A、B兩組(t=4.54～5.68，P<0.05)；而兩種藥物對A、B組細胞的IC50比較差異無顯著性(P>0.05)。

A～C：A～C組細胞,熒光，200倍；D～F：A～C組細胞,普通光，200倍

表2 各組細胞PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gp mRNA及蛋白相對表達量比較

3 討 論

化療是乳腺癌最重要的治療手段之一，但由于患者易出現MDR而嚴重降低藥物療效，致使患者病情復發和預后不佳。逆轉腫瘤細胞的MDR對提高乳腺癌的治療效果至關重要，也是國內外學者高度關注的熱點[13-14]。

大量研究表明，EMT與化療藥物的耐藥有著密切的關系[15-17]。在EMT過程中，維持上皮表型的重要黏附分子被間質表型分子如N-Cadherin及vimentin所取代，從而導致細胞間黏附性降低，細胞遷移侵襲能力增強[18]。N-cadherin和vimentin不僅僅是EMT的重要標志物，目前發現其與腫瘤的MDR也具有密切關系[19]。FISCHER等[20]研究顯示EMT可通過激活乳腺癌細胞中的乙醛脫氫酶來誘導其對環磷酰胺耐藥。SAXENA等[21]也發現EMT誘導物不僅可以增加腫瘤細胞的侵襲性，還可通過上調ABC轉運蛋白的表達，增加化療藥物的外排而致使耐藥的發生。LI等[22]發現阿霉素可誘導乳腺癌細胞系發生EMT和MDR，并且只有發生EMT的細胞侵襲性會增加并出現MDR，抑制EMT可逆轉其MDR。PRRX1是一種新發現的EMT誘導因子，能誘導癌細胞發生EMT并增加其侵襲性[7]。在乳腺癌中，PRRX1的表達與淋巴結轉移、臨床分期以及患者5年生存率顯著相關[23]。LV等[24]研究結果顯示PRRX1的主要亞型之一PRRX1b在三陰性乳腺癌中顯著上調，并與腫瘤大小和周圍血管的侵犯程度相關。PRRX1b的沉默可抑制基底樣癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結果顯示，PRRX1過表達可使乳腺癌MCF-7細胞系發生EMT改變，細胞間連結松散，細胞呈紡錘形，利于細胞運動遷移，并伴隨間質表型標志分子N-cadherin和vimentin表達的增加，這與先前的研究結果相符[5，7]。

然而PRRX1在MDR中的作用尚不清楚。最近的研究表明PRRX1高表達可誘導大腸癌EMT，與其轉移、預后不良及放療耐受相關[8，25]。而在肺癌細胞中沉默PRRX1可誘導EMT并增加肺癌細胞抗凋亡能力和對順鉑的耐藥性[26-27]。上述研究提示PRRX1在不同類型的癌癥細胞中發揮著不同的作用。本研究結果亦顯示，用多西他賽和順鉑分別處理乳腺癌MCF-7細胞24 h后，C組細胞的IC50值明顯高于A組和B組，提示PRRX1過表達可致使乳腺癌細胞發生MDR。在腫瘤細胞系中，ABC轉運蛋白的過表達可增加藥物外排從而降低細胞內藥物濃度，是腫瘤細胞獲得耐藥性最主要的機制之一[28-29]。由MDR1基因編碼的P-gp，又稱ABCB1，是研究最深入的ABC蛋白，長期以來被認為是克服腫瘤MDR的重要靶點[30]。P-gp不僅介導腫瘤細胞的MDR，而且參與調節其增殖、凋亡、遷移、侵襲及EMT等[31]。本研究通過RT-qPCR和WES蛋白定量分析系統檢測了3組細胞中P-gpmRNA和蛋白的相對表達量，結果顯示C組細胞的P-gpmRNA及蛋白表達水平較A、B兩組均明顯增高，提示PRRX1可能通過上調乳腺癌MCF-7細胞中P-gp的表達，介導MDR的發生。

綜上所述，本研究首次發現PRRX1過表達可通過誘導乳腺癌MCF-7細胞EMT而致使其發生MDR，對乳腺癌MDR發生機制的研究提供了新的思路。但MDR機制錯綜復雜，PRRX1參與這一過程的分子機制還有待進一步深入研究。