精子DNA碎片檢測在輔助生殖中的研究進展

武 健，李立鵬 綜述,曹金鳳△ 審校

1.河北醫科大學研究生學院，河北石家莊 050000；2.河北醫科大學第二醫院生殖醫學科，河北石家莊 050000

目前，單獨采用常規精液分析并不能全面評估精子質量和男性生育潛力，因此，研究者將注意力轉移到精子的DNA結構上。近年來，精子DNA碎片(SDF)檢測作為常規精液分析的重要補充，被認為是評價精子功能的一項重要指標。研究發現，SDF與精子發生異常、氧化應激損傷、精子凋亡異常相關。精子DNA碎片指數(DFI)是指在各種不利因素的作用下，發生DNA斷裂的精子占全部精子的百分比，可用于精子DNA完整性的評估。精子DNA完整性是正常受精、著床和胚胎發育的必要條件，最近的研究多集中在評估DFI在輔助生殖中的臨床價值，但仍存在爭議。本文將從產生機制、檢測方法、臨床意義和治療方法4個方面綜述SDF檢測在臨床的最新研究進展。

1 SDF的產生機制

1.1精子發生異常 精子形成階段，以賴氨酸為主的組蛋白逐漸被富含精氨酸的魚精蛋白代替。在魚精蛋白的作用下，染色質高度折疊并存儲于精子頭部，以確保遺傳物質的穩定性。若二者轉化受阻,會導致染色質包裝異常和修復缺陷，引發DNA損傷。組蛋白-魚精蛋白轉換過程復雜，受多種機制調控。GOU等[1]研究發現，PIWI基因缺失或突變與人類組蛋白異常保留有關。 組蛋白甲基化、磷酸化、乙?；头核鼗ㄟ^表觀遺傳學修飾參與精子形成，可對染色質濃縮、精蛋白替代組蛋白和DNA損傷修復等過程進行調控[2]。

1.2氧化應激損傷 目前，氧化應激被認為是SDF產生最重要的發病機制。精液中的活性氧(ROS)主要來源于白細胞和未成熟精子。過量的ROS在精子細胞內積聚，會造成精子膜脂質和DNA的氧化損傷，引起DNA單鏈或雙鏈的斷裂。研究表明，ROS可直接造成DNA損傷[3]，而精子膜脂質過氧化可能是連接精子DNA損傷與精子形態、活力的橋梁[4]。還有研究指出，受損的精子DNA更容易受到ROS的攻擊，使精子DNA損傷加重[5]。

1.3精子凋亡異常 在人類生殖系統中，凋亡可去除異常生殖細胞，這一過程受多種機制調控。精子細胞的正常凋亡有助于調控精子數量，及時清除體內染色體異常的精子和保證精子質量,若精子凋亡異常，可造成DNA損傷的精子增多。引發精子凋亡異常的機制如下：一方面，具有DNA損傷的精細胞可通過某種機制逃脫正常凋亡途徑，進一步分化為成熟精子[6]；另一方面，內源性和外源性細胞凋亡信號通路激活異常可造成SDF的增加。WANG等[7]研究表明，外源性Fas/FasL信號通路激活異常與睪丸生精細胞的凋亡異常有關。RAO等[8]研究發現，內源性線粒體依賴通路可能在熱誘導的生殖細胞凋亡中起關鍵作用。

2 SDF的檢測方法

2.1精子染色質結構分析法(SCSA) SCSA作為一種間接測定精子DNA損傷的檢測方法，可以對新鮮和冷凍的精液標本進行檢測。DNA經酸處理變性后，用吖啶橙進行染色，與吖啶橙結合的雙鏈DNA發出綠色熒光，而與吖啶橙結合的單鏈DNA發出紅色熒光。利用流式細胞儀進一步評價染色細胞，被染成綠色的精子有完整的DNA,而被染成紅色的精子DNA發生了變性。根據紅色精子數量所占比例，可計算DFI，目前設立的參考閾值為30%。該方法的優點是不僅檢測速度快，變異系數低，易于室內室間標準化，而且還能同時檢測高可染性精子的百分比，評估核未完全縮合的不成熟精子情況[9]。雖然只能檢測單鏈DNA斷裂，但GAWECKA等[10]研究發現，由于相對分子質量小的吖啶橙更易與染色質結合，SCSA測試較其他方法檢測DNA鏈斷裂的靈敏度更高。

2.2末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記法(TUNEL) TUNEL是一種以異硫氰熒光素(FITC)為標志物，利用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)將帶有熒光標記的dUTP轉移至DNA損傷分子的3′-OH末端，然后通過顯微鏡或流式細胞儀定量分析DNA雙鏈和單鏈損傷的方法。TUNEL的缺點是操作復雜，耗時長且易受未洗凈非結合標志物干擾，FITC和TdT的大分子量也會降低與高度濃縮核染色質的結合效率[10]。但是RIBEIRO等[11]研究指出，若使用標準化染色方案并優化操作步驟，TUNEL具有室間可比性。 PANNER等[12]研究也顯示，TUNEL是一種直接測量真正DNA損傷的方法，如果能確定可靠的參考值，可作為不育男性個性化治療的預后測試方法。為確定TUNEL法的參考值，已經進行了多項研究，但不同類型的TUNEL試驗確定的參考值有所差異。SHARMA等[13]對95例健康男性和261例不育男性精液進行TUNEL分析發現，SDF參考值為16.8%時，特異度為91.6%，靈敏度為32.6%，陽性預測值為91.4%。但是，也有其他研究報道區分不育男性的參考值為20.3%[14]和24.3%[15]。RIBEIRO等[11]對2個實驗中心的TUNEL法進行標準化后發現，SDF的平均比率有很強的正相關關系(r=0.719)。他們進一步研究發現，若采用標準TUNEL法并對2種型號流式細胞儀進行性能校正，C6流式細胞儀檢測的SDF值為0～51.4%，平均值為15.1%(95%CI：10.1%～15.7%)，C6+流式細胞儀檢測的SDF值為0～47.5%，平均值為14.8%(95%CI：9.9%～15.2%)，二者總體r=0.984，提示性能校正對結果一致性有重要影響[16]。

2.3彗星實驗 彗星實驗也稱單細胞凝膠電泳,可有效檢測并定量分析細胞中DNA單雙鏈缺口損傷的程度。精子DNA受損傷后，超螺旋結構被破壞，斷裂的DNA片段在電場的作用下移動到陽極形成“彗星”尾，而完整的精子DNA形成“彗星”頭。在電泳過程中，由于相對分子質量小，小片段DNA比大片段DNA移動得更遠。因此，通過檢測熒光染料染色后“彗星”頭尾的熒光強度和尾部長度,可定量分析精子不同種類的DNA損傷。該方法精子用量少，可根據電泳液pH值的不同區分DNA單鏈損傷和雙鏈損傷，有助于研究不同損傷類型與不同疾病的關系。缺點是檢測耗時長，操作復雜，易受電壓、電流等因素的影響，臨床應用較困難。

2.4精子染色質擴散實驗(SCD) SCD是一種簡便快速、價格低廉的間接檢測SDF的方法，可以對新鮮和洗滌后精液標本進行檢測。正常精子的DNA經酸變性后，可去除大部分核蛋白，使DNA環黏附在殘余的核結構上形成特征光暈，而DNA完整性受損的精子不產生這種特征光暈或光暈很小。光暈的存在及大小可用來判斷精子DNA的完整性。SCD的缺點是不能區分DNA單雙鏈損傷，且光暈大小評估和背景染色難以標準化，易受主觀因素影響。

由此可見，由于原理不同，4種方法在檢測DNA損傷類型和相對靈敏度方面有明顯差異[17]。盡管SCSA檢測的室內和室間差異最小，但這項檢測仍未普及[18]。對于彗星實驗和SCD 2種檢測方法，觀察者間的變異性是主要障礙。在TUNEL分析中，檢測步驟的標準化可使變異最小化，且TUNEL檢測的實驗室間可變性低于SCSA技術[19]。

3 SDF檢測在輔助生殖中的臨床意義

3.1SDF檢測與男性不育 WHO推薦SDF檢測作為評估男性生育力的常規檢測項目[20]。WIWEKO等[21]采用SCD法檢測發現，在男性不育診斷中，DFI的診斷價值高于精液分析，DFI(26.1%)是鑒別不育男性和生育男性的最佳臨界值，靈敏度為80.8%，特異度為86.1%。最近，有學者對SDF與常規精液參數之間的相關性進行了研究。麥選誠等[22]研究發現，在不育男性中DFI與精子的濃度、活力和形態呈負相關，且與前向運動精子百分比的負相關關系最明顯，既反映出精液常規參數能為評估精子DNA完整性提供參考，又反映出DFI對于男性生育能力預測具有科學性。EVGENI等[23]通過亞組分析發現，在健康生育人群中，常規精液參數與DFI之間的相關性差異無統計學意義，表明DFI可能是精液質量的獨立指標，有必要對二者進行綜合評價。

3.2SDF檢測與常規體外受精(IVF) DFI與IVF結局的關系已得到廣泛的研究，但結論存在爭議。有研究發現，DFI增高可降低IVF受精率、妊娠率，影響胚胎質量[24]。也有研究表明，DFI與IVF受精率、優胚率、妊娠率均無關[25]。影響結果的因素有多種，如測定方法、女性生育狀況、DNA損傷類型和精液處理方式等。JIN等[26]對2 085例接受IVF治療的患者進行回顧性分析發現，DFI與妊娠率呈負相關。亞組分析發現，SDF僅在卵巢儲備減少的患者中顯著影響IVF結局,由此推測卵母細胞質量可能是降低SDF負面效應的重要因素。CASANOVAS等[27]對同一精液標本進行雙鏈和單鏈DNA斷裂分析發現，單鏈DNA斷裂僅在原核階段表現出主要作用，而雙鏈DNA斷裂會導致胚胎發育緩慢，并可能影響著床?？梢婋p鏈DNA斷裂比單鏈DNA斷裂影響更嚴重，但是大多數SDF測試只鑒定單鏈DNA斷裂，這可能是造成研究結果不一致的原因。此外，精液來源也是影響結局的混雜因素之一，多數研究只針對原始精液進行SDF檢測，并不能反映優化后精子SDF的真實狀態。

3.3SDF檢測與卵胞漿內單精子注射(ICSI) 目前大多數證據表明，SDF對ICSI結局幾乎無影響。SIMON等[28]未能發現SDF與ICSI妊娠率之間存在顯著相關性，于魯華等[29]對凍融胚胎移植周期的研究也表明，SDF引起的妊娠率下降可通過ICSI得到糾正。但是，BORGES等[30]以DFI為30%分2組探討SDF對非男性因素不孕ICSI周期的影響,發現SDF與受精率無關，與胚胎發育不良、著床率低、流產率高有關?？赡苁怯捎贗CSI過程逃避了自然選擇，人為挑選了有DNA損傷的精子。 因為父系基因組于4～8細胞期被激活，所以DNA損傷對受精沒有影響，但會影響后期胚胎發育。目前的研究仍存在一定的局限性，比如如何界定DFI參考值、主觀因素是否會干擾胚胎質量的評價、不同胚胎培養室行ICSI前卵母細胞孵育時間長短可能會影響其修復SDF的能力等，這些因素在很大程度上限制了結果的可重復性。此外，由于DNA損傷精子受精可能會增加子代患遺傳病的風險，應該對ICSI周期的患者進行密切隨訪，注意其遺傳或出生缺陷。

3.4SDF與反復流產 我國將3次或3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失定義為復發性流產[31]。反復流產最常見的原因是胚胎非整倍體,但對女性進行檢查和核型分析發現，仍然有50%的病例反復流產無法解釋。目前，關于反復流產與男性因素的研究較少。BAREH等[32]選取26例不明原因反復流產男性和31例正常生育男性，用TUNEL法檢測精子SDF，結果顯示反復流產組DFI(36.8%)明顯高于對照組DFI(9.4%)。KHADEM等[33]在一項涉及30對特發性復發性自然流產(RSA)夫婦和30對生育夫婦(對照)的隊列研究中發現，SCD法檢測的RSA組DFI(43.3%)顯著高于對照組DFI(16.7%)，這與LEACH等[34]研究結論一致。因此，對反復流產夫婦進行SDF檢測可能為原因不明早期反復流產發病機制的研究打開突破口。

4 SDF檢測用于評估各種治療方式對DNA完整性的改善效果

4.1改變生活方式 研究發現，不良生活方式因素與氧化應激引起的SDF有關，如輻射、香煙煙霧、空氣污染物、性傳播感染、體質量指數等[35]。建議對有污染物暴露史或存在不良生活方式的不育男性進行SDF測試，以便通過改變生活方式降低DFI，提高生育能力。

4.2精索靜脈曲張手術 ROQUE等[36]研究發現，精索靜脈曲張術可減少氧化應激引起的精子DNA損傷，提高生育能力，可作為減輕SDF和提高妊娠率的一種手段。AFSIN等[37]研究指出，術后3個月即可觀察到SDF情況有所改善，但是對于亞臨床型的精索靜脈曲張，手術似乎并不能提高生育能力[38]。

4.3藥物治療 氧化應激是破壞精子DNA完整性的重要因素，口服抗氧化劑可以減少活性氧的形成，是治療男性不育的有效方法。ALAHMAR等[39]研究表明，維生素E、維生素C、硒、輔酶Q10、N-乙酰半胱氨酸、鋅和L-肉堿可有效減少DNA斷裂，但是MéNéZO等[40]研究指出，抗氧化處理后精子成熟染色質含量(HDS)顯著增加，可能會干擾植入前發育過程中的父系基因活性，且研究提出對于精子HDS>20%的男性，不應使用抗氧化劑。

4.4精子獲得方法 在高SDF男性中，使用睪丸精子代替射精精子行ICSI更好。ESTEVES等[41]研究指出，睪丸精子的SDF水平低于射精精子，ICSI周期中采用睪丸精子比射精精子有更高的活產率和更低的流產率。如果男性射精精子中SDF較高，可采用睪丸內精子抽吸術獲取精子,然后行ICSI 受精可能獲得較好的妊娠結局。

4.5增加性生活頻率 BORGES等[42]研究表明，與禁欲時間2、3、4 d相比，禁欲時間1 d能顯著減少精子射精過程中DNA的斷裂，提高ICSI周期著床率、妊娠率，這可能與縮短在附睪內的儲存時間和減少自由基損傷有關。SHEN等[43]利用1～3 h禁欲精子行IVF治療并觀察臨床結局，證實短時間禁欲可降低SDF并改善臨床結局。

4.6精液優選方法 在輔助生殖技術中，精子優選是一個常規操作，采用合適的優選技術，可降低SDF。SDF檢測可用于檢測這些處理技術對 DNA 完整性的影響。最近一些研究提出精液處理的新方法，QUINN等[44]研究指出，原始精液經微流控芯片優選后，SCD檢測的精子DFI可降至0；BERTELI 等[45]研究發現，磁性活細胞分選法與密度梯度離心法聯合使用比單獨使用2種方法更能減少SDF；陳娟等[46]研究還發現，磁性活細胞分選法在降低冷凍精液DFI方面具有優勢。

5 小 結

盡管檢測SDF的方法有很多，但仍然缺乏統一明確的參考值，這使得SDF檢測在臨床的預測價值和評估價值存在爭議。TUNEL技術作為檢測SDF最直接的方法，評估SDF的準確性更高，在未來有更大的發展前景。如何通過優化操作步驟和規范操作流程，降低實驗室室內和室間變異，仍然是SDF檢測面臨的巨大挑戰。目前，SDF檢測尚處于臨床應用的起步階段，若能夠找到檢測SDF的無損害方法，直接挑選DNA完整的精子用于受精，將為輔助生殖技術的選擇提供安全和有效的保障。