針刺單穴和腧穴配伍對胃潰瘍大鼠的干預效應及其機制

哈麗娟, 王富春, 劉曉娜

（1.長春中醫藥大學針灸推拿學院實驗針灸教研室，吉林 長春 130117；2.長春中醫藥大學針灸推拿研究所，吉林 長春 130117；3.長春中醫藥大學針灸推拿學院針灸臨床教研室，吉林 長春 130117）

胃潰瘍是常見的胃和十二指腸潰瘍性疾病，表現為惡心、燒灼感、噯氣、嘔吐、嘔血、胃酸和便血等， 以反復發作的節律性胃脘部痛為典型癥狀［1］。本 病 屬 中 醫 “反 酸” 和 “噯 氣” 范 疇，西 醫認為胃潰瘍是黏膜消化性疾病，因多種因素對胃黏膜造成損傷而引起胃蛋白酶和胃酸升高導致，全世界范圍內患病率為10%［2-3］。 胃潰瘍給患者的身體、心理健康、生活和工作帶來嚴重影響，患者在患病早期，因對本病了解不足或不夠重視，導致病情加重，甚至造成糜爛性潰瘍和胃穿孔等嚴重后果，患病后需及時治療［4-5］。對于胃潰瘍的治療，目前西醫的方法比較單一，且不良反應較多。多項研究［6-10］表明：針灸可有效治療胃潰瘍，并緩解疼痛和吞酸等癥狀。腧穴的選擇是針灸取得良好療效的重要影響因素［11］，歷代醫家［12-14］對腧穴配伍可提高針灸治療胃潰瘍的臨床療效早有共識，提出了許多配伍方法，現代腧穴配伍研究［15］也取得了一定成果，然而腧穴配伍療效是否優于單穴尚無充分的科學依據，影響腧穴配伍效應的關鍵因素也尚未闡明。本實驗以正常SD 大鼠和應激性胃潰瘍模型大鼠為研究對象，采用束縛-水浸應激法造模，綜合運用形態學法和免疫組織化學法檢測電針單穴及腧穴配伍后胃潰瘍模型大鼠胃黏膜損傷指數和胃組織中上皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR） 蛋白表達情況， 探討單穴及腧穴配伍對胃潰瘍大鼠的干預效應差異及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器100 只健康雄性SD 大鼠由長春中醫藥大學動物實驗中心提供，SPF 級，體質量180～220 g，飼養于清潔動物室，相對濕度為60%～70%， 溫度（22±2） ℃， 人工照明，自由飲水。氯化鈉、氨基甲酸乙酯、多聚甲醛、石蠟、二甲苯、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、梯度乙醇、無水乙醇和蘇木精染料溶液（吉林省長春市賽因生物科技有限公司），DAB 顯色試劑盒、山羊血清和兔抗大鼠多克隆抗體（美國Sigma 公司），生物素標記山羊抗兔IgG 和辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（德國Serva公司）。 820 型薄片切片機（美國AO 公司），UPW-25N 超純水器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），光學顯微鏡（日本Nikon 公司）， 全套實驗動物手術器械（河南省南陽市臥龍漢醫艾絨廠）。

1.2實驗動物分組和處理方式100 只健康雄性SD 大鼠隨機分為空白組、模型組、中脘組、足三里組和合募配伍組，每組20 只。空白組：不造模，不治療，正常飼養；模型組：造模后不進行電針治療；中脘組：模型成功后， 電針中脘穴， 連續10 d；足三里組：模型成功后，電針足三里穴，連續10 d；合募配伍組：模型成功后，電針合募配伍（足三里+中脘穴），連續10 d。

1.3模型制備采用國際上公認的應激性胃潰瘍造模方法-束縛-浸水應激法造模［16-17］，造模24 h 之前，大鼠禁食不禁水，放置于長為20.0 cm、直徑為6.5 cm 的管狀金屬網中，懸浮于（18±2）℃的水中，水位達到大鼠的劍突處，時間為12 h，制備應激性胃潰瘍大鼠模型。

1.4各組大鼠胃黏膜損傷指數檢測10 d 后處死各組大鼠，取出胃組織，沿胃大灣剪開胃壁，將胃體翻轉，使胃內面暴露于外，采用0.9% NaCl 溶液和PBS 清洗去除污血，平置于冰塊上，在10 倍放大鏡下觀察胃黏膜組織形態表現。 參考ELIA 等［18］制定的胃黏膜損傷指數分析方法，斑點糜爛計1 分，糜爛長度＜1 mm 計2 分，1 mm≤糜爛長度＜2 mm 計3 分，2 mm≤糜爛長度≤4 mm計4 分，糜爛長度＞4 mm 計5 分；胃黏膜糜爛的計分值之和為胃黏膜損傷指數。

1.5 HE染色觀察各組大鼠胃組織病理形態表現取一小塊大鼠胃組織（5 mm×10 mm×10 mm），多聚甲醛固定脫水，4 ℃過夜，常規脫水，石蠟包埋，切片，厚度為4 μm，采用45 ℃培養箱干燥，二甲苯脫蠟，水化，蒸餾水洗滌，蘇木精染色，脫水，二甲苯透明，復玻片封口，普通光鏡下觀察各組大鼠胃組織病理形態表現。

1.6免疫組織化學法檢測各組大鼠胃黏膜組織中EGFR蛋白表達水平①取一小塊胃黏膜組織（5 mm×10 mm×10 mm），采用4% 多聚甲醛固定后，埋入石蠟進行切片，采用防脫片載玻片貼片，在60 ℃下采用烤箱烤切片30 min，采用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟； ②分別在不同梯度（100%、 95%、90% 和80%） 酒精中進行水化，各3 min，在蒸餾水中洗滌3 次，每次各2 min ； ③將 組 織 切 片 放入10 mmol·L－1（pH 6.0） 檸檬酸鹽緩沖液中高溫高壓修復3 min，自然冷卻30 min 后，PBS 浸洗3 次；④于組織切片上加入封閉血清，排除非特異性染色造成的干擾并孵育；⑤組織切片加入一抗溶液，于4 ℃條件下孵育過夜；⑥第二天于37 ℃條件下復溫60 min，PBS 溶液洗滌，切片組織加滴二抗山羊抗兔IgG 溶液，孵育60 min；⑦PBS 溶液，切片滴入過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min；⑧采用PBS 溶液沖洗，DAB 顯色液滴于每張切片組織上，鏡下隨時觀察，以確定顯色程度，之后蒸餾水反復清洗；⑨采用蘇木精復染，蒸餾水反復沖洗； ⑩梯度酒精分化， 每個濃度2 次，每次各2 min；二甲苯Ⅰ和Ⅱ透明，取出切片，擦干周圍二甲苯，中性樹膠滴在組織旁，再用清潔蓋玻片蓋上，先放平一側，再放下另一側，以免產生氣泡，封好片子后置于通風柜中晾干。結果判定：陽性結果為細胞膜上或細胞質中有黃色或棕黃色的EGFR 蛋白質染色。每個樣本拍攝3 個不同位置，采用Image-Pro Plus 5.0 圖像分析系統測定EGFR 蛋白質染色積分吸光度 （integral absorbance，IA） 值，以IA 值代表各組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達水平。

1.7統計學分析采用SPSS 11.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠胃黏膜損傷指數和胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達水平以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠胃黏膜潰瘍情況肉眼觀察各組大鼠胃黏膜潰瘍情況可見：空白組大鼠胃黏膜顏色粉紅，無病灶和出血點；模型組大鼠胃黏膜顏色鮮紅，有明顯潰瘍灶及大面積的出血點；中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜潰瘍程度均有不同程度的減輕，合募配伍組大鼠胃黏膜潰瘍程度減輕最明顯。見圖1 （插頁二）。

2.2各組大鼠胃黏膜損傷指數空白組、模型組、中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜損傷指數分別為（1.06±0.29）、（42.33±3.57）、（25.85±6.22）、（23.63±5.32） 和（17.22±2.13） 分，模型組大鼠胃黏膜損傷指數最高，與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.05），表明束縛-浸水應激法成功建立了應激胃潰瘍大鼠模型；與模型組比較，中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜損傷指數均明顯降低（P＜0.05）；合募配伍組大鼠胃黏膜損傷指數大于中脘組和足三里組，中脘組和足三里組大鼠胃黏膜損傷指數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3各組大鼠胃組織病理形態表現空白組大鼠胃組織和竇壁結構完整，固有腺體排列整齊，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜被破壞，腺體數量減少，形狀和大小不一，排列紊亂，炎性細胞浸潤存在于細胞間隙；中脘組和足三里組大鼠黏膜細胞排列紊亂，可見部分細胞水腫及炎性細胞浸潤，組織學改變輕于模型組；合募配伍組大鼠大部分胃黏膜結構正常，上皮較完整，細胞水腫輕度，伴有少數炎癥細胞。中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜均有不同程度的修復與愈合，效果以合募配伍組最佳。見圖2 （插頁二）。

2.4各組大鼠胃黏膜組織中EGFR蛋白表達水平空白組、模型組、中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達水平分別為0.68±0.12、 1.22±0.45、 2.52±0.36、 2.96±0.33 和4.33±0.31。 模 型 組 大 鼠 胃 黏 膜 組 織 中EGFR 蛋白表達水平高于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，中脘組、足三里組和合募配穴組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與中脘組比較，足三里組大鼠胃黏膜組織中EGFR蛋白表達水平升高（P＜0.05），合募配伍組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與足三里組比較，合募配伍組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。

3 討 論

2002 年，世界衛生組織在《針灸臨床研究報告的回顧與分析》 中，詳細分析了針灸治療病癥的范圍及療效，肯定了消化性胃潰瘍是針灸治療適宜病癥，大量國內外臨床及基礎研究也證明了針灸對消化性胃潰瘍的有效性， 總有效率為75.0%～96.7%［19］。

合募配伍是本課題組經過多年臨床總結出的一種取穴簡便、配伍精煉和行之有效的腧穴配伍方法，本課題組在國內首次提出 “合募配穴治療六腑病” 的理論，并對合募配穴進行了較為深入的理論研究和配伍特點分析［20］。中脘穴是治療脾胃疾病的常用穴，屬任脈，為任脈、手太陽與少陽、足陽明之會，是八會穴之腑會，是六腑之氣匯聚之處，具有和胃健脾、降逆利水、化濕導滯、理氣化痰、安神定志之功，《循經考穴編》 記載：“一切脾胃之疾，無所不療”；孫思邈《備急千金要方》 云：“中脘主腹脹不通……憂思損傷，氣積聚，腹中甚痛……中脘主大便難”；《針灸資生經》 記載：“凡飲食不思，心腹膨脹，面色萎黃，世謂之脾腎病者，宜灸中脘”，徐靈胎曰：“募音暮，氣所結聚處”；張介賓曰：“募為臟氣結聚之所”，有學者［21］進行了針刺中脘穴治療消化性潰瘍的多中心隨機對照試驗研究，針刺中脘組患者的綜合療效優于口服泰胃美組，且針刺中脘穴可快速改善胃脘疼痛及食少的癥狀，足三里是足陽明胃經的合穴和胃腑下合穴，具有調理脾胃、補中益氣、通經活絡、疏風化濕和扶正祛邪之功能；《針灸大成》 記載：足三里 “主胃中寒，心腹脹滿，腸鳴，臟氣疲憊，真氣不足，腹痛食不下，大便不通……”；《針灸甲乙經》 記載：“五臟六腑之脹，皆取三里……水腫脹，皮腫，三里主之”。該穴主治腑病偏于通降［22］，腑 “以通為用，以降為順”。

中脘和足三里配伍屬合募配伍，合募配伍是指將六腑的下合穴與本經的募穴配伍，因兩穴特點皆為治療腑病，所以合募配伍是取兩者在主治上的共性，相互協調，增強療效，是以治療六腑病證為主的一種配伍方法，下合穴在主治上偏于內腑，重在通降；募穴在主治上亦偏重內腑或陽經的病邪。因此將合募相配，更適于治療腑病、實證、熱證。下合穴位于下肢，其位在下，與臟腑有縱向聯系；募穴位于胸腹部，其位在上，與臟腑有橫向聯系，二者相配屬上下近遠配穴。一升一降，升降相合，縱橫協調，氣機通暢，陰陽相續而腑病可除。有學者［23］觀察針刺治療幽門螺旋桿菌療效，對38 例患者進行合募配伍（中脘+足三里） 法針刺治療，取得了滿意的療效。

束縛-浸水應激動物模型是在眾多非損傷應激性潰瘍動物模型制作方法中應用最廣泛的造膜方法，是國際上公認的應激性胃潰瘍造模方法。應激性胃潰瘍是指在嚴重創傷，各種手術、燒燙傷、感染和敗血癥等應激狀態下發生的急性胃黏膜病變，特征為淺表性、糜爛炎性潰瘍及出血［24］。該模型的制備需要從身體、心理、神經、情緒和精神等方面產生強烈刺激，與臨床上患者的發病原因十分相似［25］。情緒變化對胃黏膜與消化系統的影響度極高，可激發胃潰瘍癥狀的發生或加重，當機體、軀體或心理處于應激狀態時，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA 軸），增加胃動素的分泌［26］，而胃動素的分泌也促進了酸性胃液的分泌，即引起消化道黏膜糜爛和潰瘍。本實驗模型大鼠從肉眼形態可看到胃黏膜顏色鮮紅，有明顯潰瘍灶及大面積的出血點，觀察HE 染色后的組織病理學，可見大鼠胃黏膜結構被破壞，數量變異，腺體形狀變異且排序紊亂，炎性細胞浸潤存在于細胞間隙，由此確定本實驗的束縛-浸水應激法制作應激性胃潰瘍大鼠模型制備成功。

EGFR 是上皮生長因子（epidermal growth factor， EGF） 的受體， 是表皮生長因子（ErbB）家族的一種， 其作用是控制細胞增殖和信號轉導［27-28］。EGFR 對 細 胞 外 配 體 結 合 區 域 的EGF 及轉 化 生 長 因 子α （transforming growth factor- α，TGF-α） 的親和性較高，與EGF 和TGF-α 結合后，EGFR 被激活，激活的受體復合體刺激細胞膜內的ras 蛋白， 激活一系列絲裂原激活蛋白（mitogen activating protein， MAP） 激 酶 級 聯 反 應， 激 活P13K、MAPK 和Src 及其他信號轉導通路，這些信號通路控制細胞的增生、分化和生存［29］。大量研 究［30-31］表 明：EGFR 的 表 達 與 胃 黏 膜 的 修 復 存在關聯，即EGFR 與可自發磷酸化的配體結合起來，促進多條下游信號通路的激活及通路上相關蛋白的分泌，可修復受損胃黏膜，治療胃潰瘍。

本研究結果表明：電針可促進EGFR 的表達，并推測可能基于此促進了胃黏膜細胞增生、分化和生存，且合募配伍治療效果最佳，為電針合募配伍促進胃黏膜修復以及胃潰瘍的治療提供了生物學依據。