鏈霉菌CPCC 203577產生的napyradiomycins的分離與鑒定

李書芬，胡辛欣，胡曉敏，江冰婭，劉曉巖，劉紅宇，余利巖，武臨專

論著

鏈霉菌CPCC 203577產生的napyradiomycins的分離與鑒定

李書芬，胡辛欣，胡曉敏，江冰婭，劉曉巖，劉紅宇，余利巖，武臨專

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所衛健委抗生素生物工程重點實驗室/中國醫學科學院藥物合成生物學重點實驗室

對一株具有抗菌活性的鏈霉菌CPCC 203577 產生的次級代謝產物進行系統研究。

采用 ISP2 瓊脂平板發酵培養鏈霉菌CPCC 203577，乙酸乙酯提取發酵培養物，獲得粗提物；粗提物經反相色譜柱、凝膠色譜柱、制備型 TLC 和半制備 HPLC 等分離純化獲得目標化合物純品；MS 和 NMR 等確定化合物結構；瓊脂稀釋法測定抗菌活性。

從鏈霉菌CPCC 203577 中分離鑒定了含萘醌并吡喃母核的 3 個已知化合物，3-chloro-6,8-dihydroxy-8-α- lapachone（1）、16-dechloro-16-hydroxynapyradiomycin C2（2）和 napyradiomycin A2（3）。化合物1具有較強的抗革蘭氏陽性細菌活性，最低抑菌濃度（MIC）值為 4 ~ 8 μg/ml；化合物2和3沒有抗菌活性。

鏈霉菌 CPCC 203577 具有豐富的次級代謝產物合成能力，產生napyradiomycins 類化合物。

鏈霉菌CPCC 203577； napyradiomycins； 抗菌活性

鏈霉菌是一類可產生結構多樣、生物活性豐富的次級代謝產物的放線菌；臨床使用的鏈霉素和達托霉素（daptomycin）等抗菌藥物均來源于鏈霉菌。隨著細菌耐藥性的日趨嚴重，急需發現具有新結構和作用機制的抗生素。對鏈霉菌產生的次級代謝產物進行系統挖掘，有望為新型抗生素的研發提供先導化合物。

Napyradiomycins 是鏈霉菌產生的一類具有顯著抗菌、抗細菌生物膜與腫瘤細胞毒活性的化合物[1-7]。Napyradiomycins 的分子中含有一個萘醌并吡喃母核，該母核可連接不同結構修飾的萜鏈。

鏈霉菌 CPCC 203577 是分離自云南省景洪曼亭的一株土壤鏈霉菌，具有顯著的抗菌及抗腫瘤細胞活性。本文作者前期研究表明，該菌株產生衣草花青菌素等吩嗪類化合物，并且微生物化學分析提示菌株還產生其他結構類型的活性次級代謝產物。本文作者對該菌株產生的脂溶性次級代謝產物進行挖掘，發現并鑒定了 3 個含有萘醌并吡喃母核的 napyradiomycins 類化合物，具體報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鏈霉菌CPCC 203577，中國藥學微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養基 種子培養基：葡萄糖 2.8 g/L、酵母提取物 2.8 g/L、麥芽提取物 7.0 g/L、甘露醇6.0 g/L、豆粉 6.0 g/L、瓊脂粉 15.0 g/L，pH 自然。發酵培養基：ISP2（葡萄糖 4.0 g/L、酵母提取物4.0 g/L、麥芽提取物 10.0 g/L、瓊脂粉 15.0 g/L，pH 自然）。

1.1.3 儀器與試劑 酵母提取物和麥芽提取物均為英國 Oxoid 公司產品；微生物培養所需的其他原料均為國產試劑；乙酸乙酯、甲醇等有機試劑為國產分析純試劑；乙腈為美國 Fisher 公司產品；液相用水為屈臣氏蒸餾水；ODS 預裝柱為瑞典 Biotage 公司產品；Sephadex LH-20 凝膠為美國 GE Healthcare 公司產品；HPLC 分析色譜柱 Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）與 HPLC 半制備色譜柱 Diamonsil C18（10.0 mm × 250 mm，5 μm）購自北京迪科馬科技有限公司；薄層色譜硅膠板購自煙臺江友硅膠開發有限公司。

樣品濃縮使用 EYELAN-1100 型旋轉蒸發儀；化合物HPLC 分析和半制備使用安捷倫 1260 高效液相色譜儀；LC-MS 分析使用 Thermo Fisher Scientific 公司 LTQ XL 質譜分析儀；化合物 NMR 測試使用 Bruker Aviiihd 公司核磁共振儀（600 MHz，TMS 為內標）。

1.2 方法

1.2.1 鏈霉菌 CPCC 203577 培養與發酵 將保藏的鏈霉菌 CPCC 203577 孢子懸液涂布于種子培養基平板，28 ℃靜置培養 8 ~ 10 d 后，用適量無菌水洗下平板上的孢子。孢子懸液均勻涂布于發酵培養基平板（ISP2），28℃靜置培養 20 d，獲得發酵培養物共 20 L。

1.2.2 化合物分離純化 鏈霉菌 CPCC 203577 發酵培養物用乙酸乙酯浸泡提取 3 次，合并提取液，減壓濃縮獲得發酵培養物的提取物。提取物經 ODS 反相柱層析、Sephadex LH-20 層析、硅膠板 TLC 與半制備反相 HPLC 后，分別得到化合物1~3。

1.2.3 抗菌活性測定 參照 CLSI 標準[8-9]，采用平皿二倍稀釋法進行 MIC 測定實驗。試驗菌包括表皮葡萄球菌（ATCC 12228，甲氧西林敏感株）、表皮葡萄球菌（13-3，甲氧西林耐藥株）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213，甲氧西林敏感株）、金黃色葡萄球菌（16-30，甲氧西林耐藥株）、金黃色葡萄球菌（ATCC BAA-976，克林霉素耐藥株）、人葡萄球菌（ATCC 35982）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯桿菌（ATCC 700603）與鮑曼不動桿菌（ATCC 19606）等。試驗菌用 MH 肉湯增菌，化合物1 ~ 3用 MH 肉湯二倍稀釋成各個所需濃度，分別加適量到平皿中，MH 瓊脂培養基熔化后定量注入含待測化合物的平皿內混勻。化合物1的樣品終濃度為 16、8、4、2 和 1 μg/ml 等，化合物2和3的樣品終濃度為 64、32、16、8、4、2 和 1 μg/ml 等。接種試驗菌（接種量為104CFU/點）后置 35 ℃恒溫培養 18 h 后觀察結果，無菌生長的平皿中所含藥物最小的濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結果

2.1 化合物 1 ~ 3 分離純化

采用圖 1 所示分離純化流程，得到了化合物1~ 3純品。其中，ODS 反相柱層析采用 120 g 預裝柱，甲醇-水梯度（50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0，V/V）洗脫，流速 20 ml/min。化合物2和3的 HPLC 半制備分析條件為 62% 乙腈-水等度洗脫，流速 1.8 ml/min，保留時間分別為 43 min 與 71 min。化合物1的硅膠板制備 TLC 展層體系為二氯甲烷-甲醇（9:1），HPLC 半制備分析條件為 60% 乙腈-水等度洗脫，流速 1.8 ml/min，保留時間為 18 min。

圖 1 化合物1~3的分離純化流程

Figure 1 Purification flowchart of compounds 1 - 3

圖 2 化合物1~3的紫外吸收光譜

Figure 2 UV spectra of compounds 1 - 3

2.2 結構解析

化合物1為橙色針狀結晶，電噴霧質譜（ESIMS）確定其分子量為 308；結合其 NMR（600 MHz，DMSO-6）數據，確定其分子式為 C15H13ClO5。化合物1 的吸收光譜在 264、312 與 448 nm 有最大吸收（乙腈中，圖 2）。經化合物微譜數據庫查詢和文獻檢索，發現化合物1的核磁數據與文獻[10]報道的 3-chloro-6,8-dihydroxy- 8-α-lapachone 一致，因此確定化合物1為 3-chloro-6,8-dihydroxy-8-α-lapachone（圖 3）。化合物1的核磁數據見表 1。

圖 3 化合物1~3的結構

Figure 3 Structures of compounds 1 - 3

表 1 化合物1 ~ 3的 NMR 數據

化合物2為黃色粉末，ESIMS 確定其分子量為 494；結合其 NMR（600 MHz，CDCl3）數據（表 1），確定其分子式為 C25H28Cl2O6。化合物2的紫外吸收光譜在 274 與 348 nm 有最大吸收（乙腈中，圖 2）。經化合物微譜數據庫查詢和文獻檢索，發現化合物2的核磁數據與文獻[11]報道的16-dechloro-16-hydroxynapyradiomycin C2 一致，因此確定化合物2為16-dechloro-16- hydroxynapyradiomycin C2（圖 3）。

化合物3為黃色油狀，ESIMS 確定其分子量為 496，結合其 NMR（600 MHz，CDCl3）數據（表 1），確定其分子式為 C25H30Cl2O6。化合物3的紫外吸收光譜在 252、273 與 362 nm 有最大吸收（乙腈中，圖 2），與文獻[11]報道的napyradiomycins 類化合物的紫外吸收光譜相似，并且其核磁數據與napyradiomycin A2 一致，因此確定化合物3為 napyradiomycin A2（圖 3）。

2.3 抗菌活性

以左氧氟沙星（levofloxacin）為陽性對照，對化合物1~3進行了體外抗菌活性測定。化合物1對多數革蘭氏陽性細菌顯示較強活性，其中對表皮葡萄球菌的 MIC 值為 4 μg/ml，對金黃色葡萄球菌和人葡萄球菌的 MIC 值為 4 ~ 8 μg/ml；而化合物2和3沒有抗菌活性（MIC 值≥ 64 μg/ml）。化合物1~3對大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌與鮑曼不動桿菌等革蘭氏陰性細菌均沒有活性。

3 討論

Napyradiomycins 是一類由芳香聚酮和萜類組分組成的雜萜類化合物，1986 年首次從采自日本土樣中的放線菌G802-AF1 中分離得到[1-3]；隨后從鏈霉菌中發現了在萘醌母核或萜類組分具有不同修飾的多個 napyradiomycins 類化合物[10-16]。雖然文獻報道的napyradiomycins 類化合物達 40 多個，但從同一株鏈霉菌中同時發現化合物1~3系首次報道。

本文作者對化合物1~3的抗菌活性測定結果表明，1具有較強的抗革蘭氏陽性菌活性，而2和3沒有抗菌活性。文獻報道化合物1的 C-8 位-甲基化類似物()-3-chloro-6-hydroxy-8- methoxy-α-lapachone 沒有抗菌活性[11]，提示萘醌并吡喃母核發生取代修飾可能會導致抗菌活性丟失。化合物2與文獻報道的 napyradiomycin C2 均發生了單萜組分修飾（與萘醌并吡喃母核成環，以及C-16 位的羥基或氯取代），它們均沒有抗菌活性[17]。化合物3與具有顯著抗菌活性的 napyradiomycin A1 相比較，其單萜部分發生了 C-16 位的羥基修飾和 C-17 位雙鍵位置變化，導致化合物抗菌活性丟失。

鏈霉菌 CPCC 203577 除了產生吩嗪類和 napyradiomycins 類化合物之外，可能還產生其他結構類型的次級代謝產物，值得繼續挖掘。

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Isolation and identification of napyradiomycins fromsp.CPCC 203577

LI Shu-fen, HU Xin-xin, HU Xiao-min, JIANG Bing-ya,LIU Xiao-yan, LIU Hong-yu, YU Li-yan, WU Lin-zhuan

To investigate the secondary metabolites fromspCPCC 203577.

spCPCC 203577 was cultured on agar plates and then extracted with EtOAc. The extracts were fractionated by ODS and Sephadex LH-20 column chromatography, followed by preparative TLC and/or semi-preparative HPLC, which yielded compounds 1 - 3. MS and NMR were used to elucidate the structures of 1 - 3. Agar dilution method was used to assay the antibacterial activities of 1 - 3.

Three napyradiomycins were characterized fromspCPCC 203577. Their structures were confirmed to be 3-chloro-6, 8-dihydroxy-8-α-lapachone (1), 16-dechloro-16-hydroxynapyradiomycin C2 (2) and napyradiomycin A2 (3), respectively. Compound 1 showedactivity against Gram-positive bacteria, while 2 - 3 were inactive against both Gram-positive and Gram-negative bacteria.

spCPCC 203577 produces napyradiomycins, a group of secondary metabolites with a pyranonaphthoquinone core.

spCPCC 203577; Napyradiomycins; Antibacterial activities

WU Lin-zhuan, Email:wulinzhuan@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.004

Author Affiliation:NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, CAMS Key Laboratory of Synthetic Biology for Drug Innovation, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

國家微生物資源基礎平臺（NIMR-2018-3）；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程（2016-I2M-3-012）

武臨專，Email：wulinzhuan@imb.pumc.edu.cn

2019-07-17