候選無細胞百白破-Sabin株滅活脊髓灰質炎聯合疫苗在大鼠上的免疫保護效果研究

姬秋彥，江文文，梁疆莉，顧琴，高娜，馬艷，牟大超，史荔，孫明波

論著

候選無細胞百白破-Sabin株滅活脊髓灰質炎聯合疫苗在大鼠上的免疫保護效果研究

姬秋彥*，江文文*，梁疆莉，顧琴，高娜，馬艷，牟大超，史荔，孫明波

650118 昆明，中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室

觀察候選無細胞百白破-Sabin 株滅活脊髓灰質炎聯合疫苗（DTaP-sIPV）在大鼠中的免疫保護效果，為疫苗臨床前研究提供依據。

將候選疫苗 DTaP-sIPV、無細胞百白破-滅活脊髓灰質炎-b 型流感嗜血桿菌聯合疫苗（DTaP-IPV/Hib）、吸附無細胞百白破-b 型流感嗜血桿菌聯合疫苗（DTaP/Hib）、百日咳疫苗效力參考品（全細胞疫苗，wP）按 0、30、60 d 3 劑免疫程序免疫 Wistar大鼠，檢測各組大鼠每劑免疫后的血清中各組分抗體水平。在免疫完成后 3 周，用百日咳 18323 株通過氣霧攻擊的方式感染大鼠。在感染后的第 3、7、14、21 和 28 天檢測各組白細胞數、肺部菌落克隆形成數以及百日咳疫苗組分抗體變化水平。

候選疫苗組 3 劑次免疫完成后 PT 抗體幾何平均滴度（GMT，log2）為16.74，FHA 抗體 GMT 為18.44，PRN 抗體 GMT 為 10.75，DT 抗體GMT 為 17.34，TT 抗體 GMT 為 17.84，針對 3 種 Sabin 脊髓灰質炎病毒株（I、II 和 III 型）的抗體的 GMT 分別為 7.57、8.41 和 9.70，均達到 100% 陽轉。候選疫苗抗原組分抗體除了 PRN 和 I 型 IPV 外，其他組分抗體水平均與疫苗對照組相比無顯著性差異。在基礎免疫完成后 3 周對大鼠進行百日咳桿菌氣霧攻擊，各疫苗組均表現較好的保護效果，白細胞水平都呈現平穩狀態，雖然在肺部也檢測到少量細菌定植，但各疫苗組間差異不明顯，且在感染后第 28 天都清除至檢測限；而空白對照組在肺部則檢測到了大量細菌定植，且在感染后第 28 天都并未清除至檢測限，百日咳特異性的 FHA 和 PRN 抗體在感染后的第 14 天也出現了相應的升高。

候選疫苗在 Wistar 大鼠模型上具有較好的免疫保護效果。

無細胞百白破-Sabin株脊髓灰質炎聯合疫苗； 免疫； 感染； 保護效果

百日咳是一種主要由百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）引起的急性呼吸道傳染病。疫苗使用之前，百日咳是全球嬰幼兒死亡的主要原因[1]。20 世紀 30 年代研制成功的全菌體百日咳疫苗（whole-cell pertussis vaccine，wP）在 40 年代得到大規模的使用，大大降低了百日咳的發病率和死亡率[2]。到 70 年代，發達國家幾乎消除了百日咳[3]。由于全菌體百日咳疫苗副反應較強，90 年代，含百日咳毒素（pertussis toxin，PT）和絲狀血凝素（filamentous haemagglutinin，FHA）或少量百日咳桿菌黏附素（pertactin，PRN）等組分的無細胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine，aP）上市后便廣泛替代 wP 使用至今[4]。aP 的不良反應發生率低于 wP，而且其抗體反應和誘導的保護時間比 wP 更快[5-6]。aP 根據抗原純化工藝的不同，又分為共純化疫苗和組分疫苗。組分苗相對于共純化苗可更好地控制抗原成分的組成、含量和質量[7-9]。我國目前使用共純化無細胞百日咳疫苗，國外進口組分苗價格昂貴，因此對自主研發的組分苗有強烈需求。本研究以中國醫學科學院醫學生物學研究所研制的無細胞百白破-Sabin 株脊髓灰質炎（脊灰）聯合疫苗（DTaP-sIPV）組分苗和已上市的無細胞百白破-滅活脊灰-b 型流感嗜血桿菌聯合疫苗（DTaP-IPV/Hib）組分苗、吸附無細胞百白破-b 型流感嗜血桿菌聯合疫苗（DTaP/Hib）共純化苗以及國家百日咳效力參考品（wP）分別免疫 Wistar 大鼠，在 3 針基礎免疫后，采用百日咳桿菌氣霧攻擊，通過抗體水平、菌落清除時間、白細胞數等指標評價新研制 DTaP-sIPV 組分苗的免疫應答和保護效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 DTaP-sIPV 由中國醫學科學院醫學生物學研究所自主研制，制備工藝簡述如下：將百日咳桿菌、白喉桿菌、破傷風梭狀桿菌分別經發酵、柱層析提純的百日咳抗原 PT、FHA 和 PRN 組分，精制白喉類毒素（DT）和精制破傷風類毒素（TT）分別用氫氧化鋁佐劑吸附制成原液；將 Sabin 株脊灰病毒接種于微載體培養的 Vero 細胞，培養后收獲病毒液，經純化和甲醛滅活后制成單價病毒原液；將吸附好的 PT、FHA、PRN、TT、DT按照所需量加入，最后加入 sIPV I、sIPV II、sIPV III。DTaP-IPV/Hib 購自深圳賽諾菲巴斯德生物制品有限公司；DTaP/Hib 購自北京民海生物科技有限公司；第七代百日咳疫苗效力國家標準品（wP）購自中國食品藥品檢定研究院。各疫苗配方見表 1。

1.1.2 實驗動物 SPF 級 Wistar 大鼠，180 ~220 g，7 ~ 9周齡，由中國醫學科學院醫學生物學研究所動物實驗中心提供。

1.1.3 試劑 百日咳攻擊菌（菌株號：18323/CMCC58030）購自中國食品藥品檢定研究院；兔抗大鼠辣根過氧化物酶標記抗體為美國 Abcam 公司產品；包被抗原 PT、FHA、PRN、DT、TT 為中國醫學科學院醫學生物學研究所保存；單組 TMB 底物顯色液為中國索萊寶公司產品；Bordet-Gengou agar base 購自海博生物技術有限公司；脫纖維羊血購自南京樂診生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物免疫及感染 將 Wistar 大鼠隨機分為 5 組（DTaP-IPV/Hib 組、DTaP/Hib 組、DTaP-sIPV 組、wP 組和空白對照組），每組 8 只，雌雄各半。分別經大鼠的左右腓腸肌進行接種，0.5 ml/劑。DTaP-IPV/Hib 和 DTaP/Hib 接種時分別只接種 DTaP-IPV 和 DTaP 抗原。每組每只大鼠注射 3 劑次，每劑次間隔 30 d，免疫前及每劑次免疫后 30 d 采血，分離血清，–20 ℃儲存。在最后一次免疫的三周后對各組大鼠進行百日咳桿菌的呼吸道感染（1011CFU/ml）[10]。于感染后的 3、7、14、21 和 28 d 取樣，每次 1 只/組，對肺部細菌進行計數。

1.2.2 血清抗體效價測定 通過 ELISA 法檢測針對白喉、破傷風和百日咳的抗體anti-PT、anti-FHA、anti-PRN、anti-DT 和 anti-TT。免疫原性判定標準：以空白對照組血清的450均值的 2.1 倍為 Cutoff 值，450值≥ Cutoff 值孔的血清稀釋度為抗體滴度，計算各組抗體的 GMT。根據世界衛生組織推薦的方法，由本所的質量控制實驗室通過微中和試驗測量I ~III 型脊髓灰質炎病毒的中和抗體[11]。

1.2.3 感染后白細胞計數 氣霧攻擊各組大鼠，于攻毒前、攻毒后 3、7、14、21 d 尾靜脈采血，采全血 200 μl，EDTA 抗凝，血球計數儀檢測白細胞數。

1.2.4 感染大鼠肺部菌落計數 每組每個采樣點隨機數字表法挑選 1 只大鼠，分離肺組織，稱取

表 1 3 種含 DTaP 聯合疫苗的抗原及佐劑配方

注：- 不含該成分；*DTaP中百日咳為共純化疫苗，含 PT、FHA 和 PRN 組分，總含量為 9 μg 蛋白氮/劑。

Notes:- Does not contain this ingredient;*Pertussis in DTaP is a co-purified vaccine containing PT, FHA and PRN components with a total content of 9 μg protein nitrogen per dose.

1.3 統計學處理

采用 SPSS 22.0 軟件進行數據分析。組間比較采用 One-way ANOVA 分析，以< 0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫后抗體水平

3 針基礎免疫后，與對照組相比，各無細胞疫苗組對百日咳、白喉和破傷風都產生了較高的體液免疫反應（圖 1A）。在所有無細胞疫苗組中第一次免疫后便觀察到了針對 PT、FHA、DT 和 TT 100%的血清陽轉率（圖 1B）。候選疫苗 DTaP-sIPV 組在第二次免疫后觀察到針對 PRN 的血清轉換率大于 80%，雖然略低于 DTaP/Hib 組和 wP 組，但在基礎免疫完成后也達到了 100% 的血清陽轉率（圖 1B3）。候選疫苗 DTaP-sIPV 組在基礎免疫完成后，anti-PT 的幾何平均滴度（GMT，log 2）為 16.74，anti-FHA 的為 18.44，anti-PRN 的為 10.75，anti-DT 的為 17.34，anti-TT 的為 17.84，與 DTaP-IPV/Hib、DTaP/Hib 和 wP 疫苗對照組相比，除了 anti-PRN 外，誘導的疫苗 GMT 均沒有顯著性差異（> 0.05）。

Figure 1 Dynamic profiles of the antibodies in rat immunized with the different vaccines [A:Antibody levels in serum (log 2);B:Seroconversion rates;*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001]

候選疫苗 DTaP-sIPV 基礎免疫完成后誘導的針對 3 種 Sabin 脊髓灰質炎病毒株（I、II 和 III 型）的抗體的 GMT（log 2）分別為 7.57、8.41 和 9.70；其中 I 型 IPV 的 GMT 與 DTaP-IPV/Hib 組相比稍低（< 0.05），II 型和 III 型的 GMT 與之相比無統計學差異（圖 1A6-A8）。但在第一次免疫后，DTaP-sIPV 組針對 I 型 IPV 的中和抗體呈現 100%血清陽轉率，高于 DTaP-IPV/Hib 組（圖 1B6）。與 DTaP-IPV/Hib 組相比，DTaP-sIPV 組在第一次和第二次免疫后針對 II 型脊髓灰質炎病毒的血清陽轉率均較低，但在第三次免疫完成后血清陽轉率均達到了 100%（圖 1B7）。針對 III 型 IPV，DTaP-IPV/Hib 和 DTaP-sIPV 組在第二次免疫完成后便達到了 100% 的血清陽轉率（圖 1B8）。

2.2 感染后大鼠白細胞變化和肺部菌落定植情況

百日咳桿菌氣霧攻擊小鼠后第 3 天，空白對照組白細胞數出現了明顯的升高，并在感染后的第 7 天達到峰值，而各疫苗組白細胞呈平穩狀態（圖 2A）。此外，在感染后的第 3 天，空白對照組肺部檢測到大量的百日咳桿菌存在，并在感染后第 7 天達到峰值，隨后緩慢下降；其余 4 組疫苗組肺部也檢測到少量百日咳桿菌的存在，且組間的肺部菌落克隆數無明顯差異（圖 2B）。

2.3 感染后針對百日咳組分抗體變化情況

所有無細胞疫苗組在每個時間點均誘導較高PT 抗體滴度且呈平穩狀態，而 wP 不誘導 PT 的高抗體水平，這與空白對照組的 PT 抗體變化趨勢一致（圖 3A）。wP 組的 FHA 抗體水平在感染后的第 7 天略有升高之后趨于平穩，其余幾組疫苗組在感染后的 FHA 抗體水平呈平穩狀態（圖 3B）。候選疫苗 DTaP-sIPV 組的 PRN 抗體水平在感染后的第 14 天到第 28 天明顯升高（< 0.05），而其余幾組疫苗感染后的 PRN 抗體水平呈平穩狀態（圖 3C）。空白對照組針對 FHA 和 PRN 的抗體滴度在感染后的第 14 天顯著增加并且在隨后的時間點仍保持高水平（圖 3B-3C）。

圖 2 各組感染后大鼠白細胞變化情況（A）和肺部百日咳桿菌菌落計數（B）（*P < 0.05，***P < 0.001）

Figure 2 The change of WBC (A) and colony counting (B) of five groups in post-infection (*< 0.05,***< 0.001)

Figure 3 Changes of antibody levels against vaccine components of pertussis in Wistar rats after infection (A:The change of anti-PT levels; B:The change of anti-FHA levels; C:The change of anti-PRN levels;*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001 versus the 3rd day after challenge from the same group)

3 討論

疫苗免疫后抗體水平是反映機體體液免疫的主要評價指標，本研究中對候選 DTaP-sIPV 的各組分抗體滴度進行了檢測。結果顯示在基礎免疫完成后，對于百白破的 5 個組分 PT、FHA、PRN、DT 和 TT 來說，除 anti-PRN 外，候選疫苗 DTaP-sIPV 與 DTaP-IPV/Hib、DTaP/Hib 和 wP 疫苗對照組相比，誘導的 GMT 均沒有顯著性差異。對于 PRN 抗體，DTaP-IPV/Hib 配方里不含 PRN 組分，DTaP-sIPV 組在基礎免疫完成后，anti-PRN 水平低于相應 DTaP/Hib 疫苗對照組。候選疫苗 DTaP-sIPV 與 DTaP/Hib 兩種疫苗生產工藝不同，可能是造成這兩種疫苗 anti-PRN 水平不同的原因之一。此外，疫苗組中只有 DTaP-IPV/Hib 組和候選疫苗 DTaP-sIPV 組含有 IPV 抗原，3 針免疫完成后，DTaP-IPV/Hib 組的 I 型 IPV 抗體滴度高于候選疫苗 DTaP-sIPV 組，而兩組間的 II 型和 III 型 IPV 抗體滴度沒有統計學差異。以上結果都說明候選疫苗 DTaP-sIPV 在大鼠體內具有較好的免疫原性，且疫苗各組分間無明顯的干擾或減弱現象。

在基礎免疫完成后，對各組大鼠進行百日咳氣霧攻擊，結果發現 4 個疫苗組能夠抵御百日咳攻擊，其白細胞呈現較平穩的狀態，無明顯升高，而空白對照組顯示不能抵御百日咳攻擊，其白細胞在感染后的第 3 天明顯升高并在第 14 天達到峰值。此外，空白對照組在百日咳感染后肺部形成大量百日咳桿菌克隆，在感染后的第 7 天達到峰值，并且在感染后的第 28 天還未清除至檢測限。而其余 4 組疫苗雖然大鼠肺部也檢測到了少量百日咳桿菌的存在，但組間的肺部菌落克隆數無明顯差異，并且在感染后的第 28 天已被清除至檢測限。

另外，在百日咳桿菌感染后，我們還檢測了各組大鼠血清中針對百日咳疫苗抗原特異性的抗體水平。各組的 PT 抗體基本呈現較平穩的狀態；wP 組的 FHA 在感染后的第 7 天略有升高，隨后保持平穩，空白對照組，在感染后的第 14 天出現了明顯升高，并且隨后的檢測時間點一直保持較高水平，其余疫苗組在感染后未出現明顯變化趨勢；對于 PRN 抗體，除了對照組在感染后的第 14 天出現了明顯升高外，候選疫苗 DTaP-sIPV 在感染后的第 14 天也出現了升高。這可能是由于前面所提到的 DTaP-sIPV 組在基礎免疫完成后 PRN 抗體水平較低有關。PRN 由于其介導對呼吸道上皮的黏附作用，因而被包含在無細胞百日咳疫苗中[12-13]。盡管在臨床試驗中，含有 PRN 比不含 PRN 的無細胞疫苗更有效，但目前關于 PRN 及其特異性抗體的作用還不是很清楚[14-16]。

本研究在 Wistar 大鼠模型上評價了候選疫苗 DTaP-sIPV 的免疫原性和對百日咳桿菌感染的保護效果。實驗結果表明，DTaP-sIPV 在大鼠上不僅能夠誘導機體產生具有保護作用的抗體水平，還能夠直接抵御百日咳桿菌氣霧感染。總的來說，Wistar 大鼠模型評價結果顯示，候選疫苗 DTaP-sIPV 免疫保護效果不劣于實驗中所使用目前市售疫苗。

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Immunoprotective effect of a candidate diphtheria, tetanus, acellular pertussis and Sabin strain inactivated poliovirus combined vaccine in rat model

JI Qiu-yan, JIANG Wen-wen, LIANG Jiang-li, GU Qin, GAO Na, MA Yan, MOU Da-chao, SHI Li, SUN Ming-bo

We aim to observe the immunoprotective effect of a candidate diphtheria, tetanus, acellular pertussis and Sabin strain inactivated poliovirus combined vaccine (DTaP-sIPV) in rat model for further preclinical research.

Candidate diphtheria, tetanus, acellular pertussis and Sabin strain inactivated poliovirus combined vaccine (DTaP-sIPV), diphtheria, tetanus, acellular pertussis, inactivated poliovirus and Haemophilus type b combined vaccine (DTaP-IPV/Hib), diphtheria, tetanus, acellular pertussis and Haemophilus type b combined vaccine (DTaP/Hib), and national potency standard for pertussis vaccine (whole pertussis vaccine, wP) were immunized with Wistar rats (8/group) according to the 0, 30, and 60-day immunization schedules. The serum antibody levels of each component in each group were measured. Three weeks post immunization, the rats were infected with pertussis 18323 via aerosol injection using aerosol apparatus. The numbers of white blood cells, bacterial counting of lung, colony-forming units (CFU) from the lung tissue and specific antibodies were detected at 3, 7, 14, 21 and 28 days after infection.

In the candidate vaccine group, the geometric mean titer (GMT, log2) of anti-PT, anti-FHA, anti-PRN anti-DT, and anti-TT was 16.74, 18.44, 10.75, 17.34, and 17.84, respectively. The GMT of the antibodies against the Sabin poliovirus strains (types I, II and III) were 7.57, 8.41 and 9.70, respectively, both achieving 100% positive conversion. In addition to PRN and type I - IPV, the antibody levels of the candidate vaccine antigen components were not significantly different from those of the vaccine control group. The rats were challenged withthree weeks after the completion of basic immunization. Each vaccine group showed better protection, and white blood cell levels were stable. Although a small amount of bacterial colonies were detected in the lung tissues, there no obvious difference in the vaccine groups, and the bacterial colonies were cleared to the detection limit on the 28th day after infection. However, a large number of bacterial colonies were detected in the lung tissues of the control group and they were not cleared to the detection limit on the 28th day after infection. And there was also a corresponding increase in pertussis-specific FHA and PRN antibodies on the 14th day after challenge.

The candidate vaccine shows a good immunoprotective effect in the Wistar rat model.

Diphtheria, tetanus, acellular pertussis and Sabin strain inactivated poliovirus combined vaccine; Immunization; Infection; Protective effect

SUN Ming-bo, Email:smb@imbcams.com.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.005

Author Affiliation:Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infections Diseases, Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Kunming 650118, China

國家科技重大專項（2015ZX09101031）；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程重大協同創新項目（2016-I2M-1-019）

孫明波，Email：smb@imbcams.com.cn

2019-08-02

*同為第一作者