苯磺酸左旋氨氯地平片微生物限度檢查及方法驗證

張聰聰，程龍，毛騰霄

技術與方法

苯磺酸左旋氨氯地平片微生物限度檢查及方法驗證

張聰聰，程龍，毛騰霄

610046 成都市食品藥品檢驗研究院

苯磺酸左旋氨氯地平為二氫吡啶類長效鈣離子拮抗劑，主要用于治療高血壓和心絞痛，因其療效顯著、作用持久、副作用低，在臨床得到廣泛應用[1]。微生物限度作為質量控制的指標之一，應在生產過程中進行監(jiān)測并對最終產品進行檢查[2]。之前有文獻按照《中國藥典》2010 年版要求，對其進行微生物限度方法驗證，并報道該藥物具有一定的抑菌性[3]。而《中國藥典》2015 年版[4]與 2010 年版相比，在方法驗證中所使用的菌株與判斷標準都有所變化，且目前尚未有相關的文獻報道。故本試驗按照《中國藥典》2015 年版四部非無菌藥品微生物限度標準規(guī)定，對苯磺酸左旋氨氯地平片進行微生物限度檢查及方法驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 苯磺酸左旋氨氯地平片由四川省百草生物藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格：5 mg，批號：Y171201、Y180101、Y180102。

1.1.2 儀器 BHC-1000ΙΙA/B3 生物安全柜購自蘇凈集團安泰公司；DK-600S 型三用恒溫水箱購自上海精宏試驗設備有限公司；LRH-250 生化培養(yǎng)箱、GHP-9270 隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學儀器有限公司；HVA-110 高壓滅菌鍋購自日本 Hirayama 公司；YT-X30 微生物限度檢測儀購自杭州盈天科學儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、蛋白胨均由北京三藥科技開發(fā)公司生產，按標簽說明進行配制。

1.1.4 菌種 金黃色葡萄球菌（）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌（）[CMCC(B)631001]、銅綠假單胞菌（）[CMCC(B)10104]、大腸埃希菌（）[CMCC(B)44102]、白色念珠菌（）[CMCC(F)98001]、黑曲霉（）[CMCC(F)98003]均來源于中國食品藥品檢定研究院，均為第 4 代培養(yǎng)物。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 按照《中國藥典》四部制備金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的 50 ~ 100 CFU/ml 的菌懸液，進行活菌計數(shù)備用。

1.2.2 供試液制備[5]分別取本品 10 g（批號：Y171201、Y180101、Y180102），加 pH 7.0 的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至 100 ml，勻漿儀混勻得 1:10 供試液。

1.2.3 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法驗證試驗

1.2.3.1 常規(guī)法 ①試驗組：取上述 5 種試驗菌懸液0.1 ml，分別加到 10 ml 的 1:10 供試液中，混勻，取 1 ml 注入平皿，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，凝固后倒置培養(yǎng)，置 33 ℃培養(yǎng) 5 d計數(shù)；②菌液對照組：取 5 種試驗菌懸液 0.1 ml，分別加至10 ml pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，取 1 ml 的試驗菌液注入平皿，同試驗組操作；③供試品對照組：取 1:10 供試液 1 ml 注入平皿中，同試驗組操作。試驗組回收率=（試驗組菌落數(shù)– 供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)。

1.2.3.2 稀釋法 取 1.2.2 項下的 1:10 供試液 1 ml，加 pH 7.0 的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至 10 ml，混勻得 1:100 供試液。將除黑曲霉外的 4 種菌懸液 0.1 ml，加至 10 ml 的 1:100 供試液中，混勻，取 1 ml 注入平皿，平行制備2 個平皿，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，測定菌落數(shù)，計算回收率。

1.2.3.3 薄膜過濾法 取 1.2.2 項下的 1:10 供試液1 ml，用 300 ml 無菌 pH 7.0 的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗，在最后一次沖洗時分別加入 1 ml 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液。取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，測定菌落數(shù)，計算回收率。菌液對照組、供試品對照組、稀釋劑對照組同法操作。稀釋劑對照組回收率 = 稀釋劑對照組菌落數(shù)/菌液對照組菌落數(shù)。

1.2.4 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法驗證試驗

1.2.4.1 常規(guī)法 試驗組、菌液對照組、供試品對照組操作同 1.2.3.1，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置 24 ℃培養(yǎng)7 d 計數(shù)。

1.2.5 控制菌檢查方法驗證試驗

1.2.5.1 大腸埃希菌 取 1.2.2 項下 1:10 供試液 10 ml 和 50 ~ 100 CFU 試驗菌加入到 100 ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，根據(jù)相應控制菌檢查法檢出，應檢出試驗菌。

2 結果

2.1 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法的確定

常規(guī)法、稀釋法、薄膜過濾法試驗結果分別見表 1 ~ 3。三個批號樣品三次獨立試驗中，采用常規(guī)法檢查，僅黑曲霉的回收率在 0.5 ~ 2 范圍內；采用稀釋法檢查，抑菌性仍不能完全消除，除黑曲霉外，僅白色念珠菌的回收率在 0.5 ~ 2 范圍內，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均小于 0.5，可見本品對細菌有較強的抑菌作用；采用薄膜過濾法檢查，以上三種細菌的回收率均達到 0.5 ~ 2 之間。故樣品的需氧菌總數(shù)計數(shù)可采用薄膜過濾法進行檢查。

2.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的確定

采用常規(guī)法檢查，結果如表 4 所示，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均在 0.5 ~ 2 之間，故本方法適用于檢測樣品中霉菌和酵母菌總數(shù)。

表 1 常規(guī)法驗證試驗需氧菌總數(shù)回收率

表 2 稀釋法驗證需氧菌總數(shù)試驗回收率

表 3 薄膜過濾法驗證需氧菌總數(shù)試驗回收率

表 4 常規(guī)法驗證試驗霉菌和酵母菌總數(shù)回收率

表 5 大腸埃希菌檢查方法（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基：100 ml）驗證結果

2.3 大腸埃希菌檢查方法的確定

結果如表 5 所示，試驗組和陽性對照組均有檢出，陰性對照組和供試品對照組均未檢出，故樣品中的大腸埃希菌可采用常規(guī)法檢查。

3 討論

已有研究表明，鈣拮抗劑苯磺酸氨氯地平可拮抗胞外的 Ca2+內流，調控銅綠假單胞菌（PA）的[Ca2+]i，從而抑制 PA 的群體感應，抑制毒力因子如蛋白水解酶和彈性蛋白酶的表達，可明顯降低綠膿毒素的表達[6]。通過對藥品微生物限度檢查所使用的方法進行驗證，檢測藥品含有的微生物含量及控制菌的量。采用準確的微生物限度檢查方法，能提高抑菌性藥品微生物檢測結果的準確性和可靠性[7]，從而為藥品生產、檢驗及監(jiān)管提供必要的理論依據(jù)。經驗證，對苯磺酸左旋氨氯地平片分別采用薄膜過濾法、常規(guī)法進行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)，采用常規(guī)法進行控制菌檢查，可以消除其抑菌活性，符合《中國藥典》2015 版的標準規(guī)定。

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張聰聰，Email：zhangcongcong1117@163.com

2019-04-08

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.013