定量核磁共振波譜法測定葡萄糖酸鈣原料藥的絕對含量

李怡然，朱明慧，朱志玲，姚靜，山廣志

技術與方法

定量核磁共振波譜法測定葡萄糖酸鈣原料藥的絕對含量

李怡然，朱明慧，朱志玲，姚靜，山廣志

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所分析測試中心（李怡然、朱明慧、朱志玲、山廣志）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院抗腫瘤與放射藥品室（姚靜）

葡萄糖酸鈣作為臨床常用藥物，主要起降低毛細血管滲透性的作用。適用于過敏性皮膚病，如蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢癥、接觸性皮炎等。作為產后出血的輔助用藥使用，能夠減少心血管不良反應[1-3]，同時也是一種膳食補充劑，用于兒童、孕婦、老年人鈣的補充[4]。

葡萄糖酸鈣的制備方法有電解氧化法、溴化法、金屬催化合成法、發酵法等。發酵法因工藝穩定，成本低廉，被多數廠家應用。發酵法是以黑曲霉為生產菌種，經菌種逐級培養，發酵代謝的酶將葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，再經碳酸鈣中和精制而成[5]。

《中國藥典》2015 年版采用 EDTA 滴定法測定葡萄糖酸鈣制劑中鈣的含量[6]，對葡萄糖酸基僅采用鑒別反應進行考察，未對其含量進行控制。有文獻采用 HPLC 法[7]或離子色譜法[8]測定葡萄糖酸鈣的含量，但由于葡萄糖酸在水溶液中存在糖酸和內酯的轉化，容易造成測量誤差。

自 1963 年 qNMR 法[9]應用于定量分析以來，其應用范圍日益廣泛，各國藥典均收載了該方法。qNMR 技術的優勢在于不需要對照品，僅以已知含量的核磁對照品作為內標，掃描待測物的共振峰面積直接計算 H 的個數，對化合物進行絕對含量的測定[10]，適用于無對照品原料藥的首次定量。

本文采用 qNMR 技術，利用無水氘代溶劑，排除了水分和殘留溶劑及其他無機物干擾，準確測定了葡萄糖酸鈣原料的絕對含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance III HD 600 MHz 核磁共振波譜儀（BBO 探頭）購自德國布魯克公司；Mettler Toledo MS105 電子分析天平購自瑞士梅特勒-托利多公司；氘代 DMSO（批號：PR-28072/07206DM1）購自美國Cambridge Isotope Laboratories 公司；葡萄糖酸鈣（批號：LC80Q34）購自北京百靈威科技有限公司；順丁烯二酸（批號：BCBM8127V，NMR對照品級，純度：99.94%）購自美國 Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取葡萄糖酸鈣和內標物順丁烯二酸各 10 mg，置離心管中，加入 1 ml 氘代 DMSO，超聲 5 min 使全部溶解，取 0.6 ml 置 5 mm核磁管中備用。

1.2.2 實驗方法 采用 600 MHz 核磁共振波譜儀，探頭為 BBO，軟件為 Topspin3.6.0。實驗溫度 T = 25℃；弛豫時間 D1 = 20 s；采集時間 AQ = 2 s；采集次數 NS = 32 次；脈沖序列為 zg30。

1.2.3 計算方法 核磁共振波譜法采用絕對定量的方式，本試驗采用順丁烯二酸作為內標，直接檢測葡萄糖酸鈣的含量，計算公式[11]如下：

A1=n1m1=n1W1/M1 A2n2m2n2W2/M2

式中 m1、m2分別為化合物 1 和化合物 2 的分子個數；n1、n2分別為相應官能團中的質子數；W1、W2分別為其質量；M1、M2分別為其分子量。

2 結果

2.1 方法的選擇

2.1.1 溶劑的選擇 葡萄糖酸鈣易溶于水，但實驗發現葡萄糖酸鈣在水中形成葡萄糖酸鈣和葡萄糖內酯的混合物。本試驗選用氘代 DMSO 作為溶劑，使葡萄糖酸鈣保持穩定狀態（圖 1）。

2.1.2 內標物的選擇 內標應有較高的純度，含有多個質子。順丁烯二酸理化性質穩定，不與溶劑和待測物反應，在1H-NMR 譜圖中僅存在一組共振峰，是選用較多的定量核磁內標物質。選取該物質 2 個烯質子的單峰為定量峰，該峰的化學位移（δ = 6.2），與葡萄糖酸鈣共振峰之間無干擾（圖2）。

2.1.3 定量峰的選擇 葡萄糖酸鈣化學位移歸屬見表 1，本試驗選擇葡萄糖酸鈣上 δ = 3.9 處的雙二重峰為定量峰，該峰與其他峰完全分離，不受其他峰干擾。

2.1.4 弛豫時間 通常延遲弛豫時間不小于 T1 的 5 倍。通過反轉恢復實驗對所有質子的共振譜線的 T1 值分別進行測試，最大縱向弛豫時間為 3.95 s，因此實驗選擇 D1 為 20 s。

A B C

圖 2 供試品氫譜

表 1 化學位移歸屬

2.1.5 掃描次數 設置掃描次數分別為 8、16、32、64 次進行試驗，為了滿足信噪比的要求（S/N ≥ 250），本實驗掃描次數設置為 32 次。

2.2 方法學驗證

2.2.1 精密度試驗 取供試品溶液，連續測定 6 次，對葡萄糖酸鈣 δ = 3.9 處共振峰和順丁烯二酸 δ = 6.2 處共振峰分別進行積分，計算定量峰與內標峰面積的比值。6 次測定結果的相對標準偏差為 0.46%，方法精密度良好。

2.2.2 重復性試驗 制備葡萄糖酸鈣供試品溶液 6 份，分別測定核磁共振氫譜，計算葡萄糖酸鈣的含量。6 次測定結果的平均值為 99.47%，RSD = 0.43%，方法的重復性良好（表 2）。

2.2.3 穩定性試驗 制備葡萄糖酸鈣供試品溶液，分別在室溫放置 0、2、4、8 h 后進行測定，計算樣品和內標定量峰面積比值。4 次測定結果的相對標準偏差為 0.63%，表明該樣品在室溫條件下 8 h 內保持穩定。

2.2.4 線性方程 精密稱取葡萄糖酸鈣 8.20、10.07、12.64、13.75、16.23 mg，內標稱樣量約為 10 mg，依法測定。以葡萄糖酸鈣與內標的質量比（X）為橫坐標，以葡萄糖酸鈣與內標定量峰面積的比值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程 Y = 0.2933X – 0.0246，相關系數= 0.9997（n = 5）。結果表明，當內標物質量為 10 mg 時，葡萄糖酸鈣在 8.20 ~ 16.23 mg 范圍內線性關系良好。

表 2 含量測定

2.3 定量結果

利用質量平衡法[12]按下式計算葡萄糖酸鈣的含量。

含量 =（100% – 干燥失重）× HPLC 純度× 100%

該樣品干燥失重結果為 0.37%，HPLC 純度為 99.96%，質量平衡法測得含量為 99.60%，與核磁定量結果（99.47%）一致。

3 討論

本實驗優化了1H-NMR 測定條件，選取氘代 DMSO 作為溶劑，以順丁烯二酸為內標，建立了葡萄糖酸鈣絕對含量測定方法。研究結果表明，葡萄糖酸鈣的 qNMR 法測定與質量平衡法定值結果基本一致。qNMR 方法所需樣品量少，不需要特定對照品，避免原料中未知成分對測定的干擾。采用 qNMR 法對該化合物進行含量測定，操作簡便，方法專屬、快速、可靠，結果準確。

隨著核磁技術發展和新式探頭的出現，計算機和軟件的升級換代，定量核磁共振波譜技術將在藥物質量評價領域提供更廣泛的應用。

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姚靜，Email：yaojh@nifdc.org.cn；山廣志，Email：shanguangzhi@imb.pumc.edu.cn

2019-09-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.014