長鏈非編碼RNA在肝癌中的作用研究進展

陳蛟，郝景程

成都醫學院第一附屬醫院肝膽胰外科，成都 610500

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范圍內常見的惡性腫瘤，其發病機制尚未明確。有研究表明，不同類別的非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)在HCC發生中的調節作用與多種病因有關，如HBV、HCV和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。已知長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)中的miRNA(microRNA)在基因表達的轉錄后調控中起關鍵作用[1]。miRNA的失調與腫瘤抑制基因的失活及HCC中癌基因的激活有關[2]。現代高通量測序分析鑒定了大量非編碼的轉錄本，其中lncRNA通過與DNA、RNA或蛋白質相互作用，參與肝癌的發生、發展、轉移等過程。LncRNA是腫瘤研究的新興領域，其在肝癌發生中的重要性和復雜性逐漸被了解。本文總結最近新發現的和發揮抑癌基因功能的lncRNA，以及與肝癌發生、發展、轉移和乙肝感染致肝癌相關的lncRNA，以期為基礎及臨床研究提供參考[3]。

1 LncRNA概述

人類基因組中超過90%為轉錄組，其中能編碼蛋白質的轉錄組占整個基因組的不到2%，大部分為非編碼序列。隨著測序技術的快速發展，已有大量lncRNA被鑒定出來。LncRNA是指超過200個核苷酸的ncRNA[3]，根據在基因組中的相對位置及方向，可分為正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因間lncRNA和基因內lncRNA。最初lncRNA被誤認為是基因轉錄的噪聲，沒有其他功能，但是隨著研究的不斷深入，發現其具有調節染色質重塑、調節DNA甲基化、組蛋白修飾、調節RNA代謝等方面的功能。此外，lncRNA還可發揮調節相鄰基因表達的作用，尤其表現在調控下游基因或被上游基因調控，從而充當癌基因或抑癌基因的角色。有文獻報道，lncRNA在胃癌、乳腺癌、HCC等多種癌細胞中異常表達[4-6]。越來越多的證據表明，lncRNA在肝癌發生、發展及臨床預后過程中具有重要作用[3]。

2 具有抑癌基因功能的lncRNA

2.1 TSLNC8(tumor suppressive long noncoding RNA on chromosome 8p12) TSLNC8位于人類染色體8p12，在HCC組織中通常表達下調。TSLNC8通過競爭性地與TKT和STAT3相互作用并調節STAT3-Tyr705和STAT3-Ser727磷酸化水平以及STAT3轉錄活性來發揮腫瘤抑制作用，從而導致IL-6/STAT3通路失活。TSLNC8是HCC的一個預后預測因子，其缺失與HCC的惡性特征高度相關，可作為HCC患者的預后指標，TSLNC8-TKT-STAT3軸是HCC治療的潛在靶點[7]。

2.2 PSTAR PSTAR位于人類染色體12q22，由2664個核苷酸組成，幾乎不編碼蛋白質，在細胞核和細胞質中均有表達。Geng等[8]發現，PSTAR通過誘導p53介導的細胞周期停滯抑制HCC細胞增殖和致瘤性。PSTAR可以結合核內不均一核糖核蛋白K(hnRNP K)并增強其類泛素化修飾，從而加強hnRNP K和p53之間的相互作用，最終導致p53穩定性增加，發揮腫瘤抑制作用。PSTAR在HCC組織中表達下調，并且低PSTAR表達預示HCC患者預后不良，尤其是具有野生型p53的患者。

2.3 miR503HG miR503HG是miR503的宿主基因，在肝癌組織中低表達。增強miR503HG表達可顯著抑制體外和體內HCC細胞的侵襲和轉移。已知miR503HG可與HNRNPA2B1蛋白特異性結合，通過泛素-蛋白酶體途徑促進HNRNPA2B1降解，降低p52和p65 mRNA的穩定性，同時抑制HCC細胞中NF-κB信號通路[9]。此外，miR503HG可與miR503協同作用以抑制HCC細胞遷移。miR503HG的表達水平與肝癌患者的復發時間和總體生存率顯著相關，是影響腫瘤復發和生存率的獨立危險因素。

2.4 MIR22HG MIR22HG位于人類染色體17p13.3，這一區域在肝癌細胞中被認為經常發生缺失、高度甲基化或失去雜合性。MIR22HG是miR-22的宿主基因，其低表達與HCC患者的腫瘤進展和預后不良有關。MIR22HG可通過衍生出的miR-22-3p競爭性結合人抗原R(HuR)導致一系列癌基因表達下調以及HMGB1信號通路失活，還可直接與HuR相互作用并調節其亞細胞定位。MIR22HG與HuR競爭性結合，導致HuR穩定的癌基因如β-catenin的表達減弱。MIR22HG通過抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移在腫瘤進展中起關鍵作用，提示了其在HCC中作為腫瘤抑制因子和預后生物標志物的潛在作用[10]。

3 肝癌發生、發展相關的lncRNA

3.1 TCF7 TCF7位于人類5號染色體，位于基因HSPA4(heat shock 70 kD protein)及TCF7(T cell factor 7)之間，長約3.6 kb，由3個外顯子組成。Wang等[11]通過轉錄組基因芯片分析鑒定出lncRNA TCF7。TCF7在腫瘤細胞及腫瘤干細胞中均高表達，但在正常肝臟及肝硬化組織中低表達。肝癌腫瘤干細胞的自我復制及腫瘤增殖均需要TCF7的參與。TCF7通過募集SWI/snf復合物于TCF7的啟動子，從而調控其表達，同時導致Wnt信號通路激活。TCF7介導的Wnt信號傳導可引起肝癌腫瘤干細胞自我更新和腫瘤傳播。

3.2 UFC1 UFC1是miRNA 34a的靶基因，可直接與mRNA的穩定蛋白HuR相互作用而調節HCC細胞中β-連環蛋白的水平[12]，還可促進HCC細胞的增殖并抑制細胞凋亡，從而促進小鼠異種移植腫瘤的生長。

3.3 HULC HULC可促進體外細胞增殖、遷移和侵襲，抑制順鉑誘導的細胞凋亡。HULC在體外和體內特異性結合YB-1(Y-box binding protein 1)蛋白。YB-1是翻譯失活的信使核糖核蛋白顆粒的主要成分，可使mRNA保持沉默狀態。HULC可以促進YB-1蛋白磷酸化，從而導致YB-1從其結合的mRNA中釋放，促進沉默的致癌mRNA的翻譯，包括細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E1和基質金屬蛋白酶3。HULC主要通過細胞外信號調節激酶促進YB-1蛋白磷酸化[13]。HCC組織中HULC的表達水平顯著高于鄰近的非癌組織。HULC的上調與肝癌分級和患者的總體生存期相關。

3.4 BRM BRM位于人類5號染色體，位于基因ACTBL2和PLK2之間，由6個外顯子(1321個核苷酸)組成，沒有編碼蛋白質的功能。在肝癌腫瘤干細胞自我更新的維持和腫瘤發生過程中均需要BRM參與。在肝癌腫瘤干細胞中，BRM與BRM基因共同參與啟動BRG1/BRM開關，同時BRG1與BRF復合物激活了YAP1信號通路。而且BRM及YAP1信號通路下游產物的表達水平與肝癌的嚴重程度呈正相關。BRM和YAP1信號通路可分別作為肝癌診斷的分子生物學標志物和潛在的藥物治療靶點[14]。

3.5 MALATA1 MALATA1位于細胞核，長度超過6 kb，在哺乳動物中廣泛存在，對基因表達調控起重要作用。SR蛋白是一類RNA結合蛋白，可調控mRNA前體的可變剪接方式。MALAT1通過調控SR蛋白家族而發揮調控作用。MALATA1在肝癌細胞中表達上調，通過Wnt信號通路的激活以及致癌基因剪接因子SRSF1的產生而扮演原癌基因的角色。MALAT1可誘導SRSF1產生，調控SRSF1的剪接目標，提高了抗凋亡剪接亞型的產生，并且通過調節S6K1的可變剪接，激活了mTOR信號通路。抑制SRSF1的表達廢除了MALAT1的致癌基因特性，提示對于MALATA1誘導的轉變，SRSF1的產生以及mTOR信號通路的激活是必不可少的。有研究揭示了MALATA1在肝癌細胞中表現為原癌基因的機制，即通過SRSF1的表達上調而調節致癌基因的可變剪接方式[15]。此外，MALAT1還可通過調控腫瘤葡萄糖代謝發揮其促腫瘤生長作用[16]。

4 與肝癌轉移相關的lncRNA

4.1 ATB Li等[17]發現ATB通過螯合miR-200上調ZEB1和ZEB2的表達，從而刺激上皮-間質轉化，并通過與IL-11 mRNA結合提高其穩定性并促進其表達，激活STAT3信號通路，從而促進早期和晚期腫瘤轉移。

4.2 MITA1 MITA1是一種由核RNA測序發現的富含染色質的lncRNA，可被能量應激顯著誘導。MITA1的這種誘導受肝激酶B1-腺苷一磷酸激活的蛋白激酶(LKB1-AMPK)途徑和DNA甲基化控制。敲除MITA1可顯著抑制肝癌細胞的體外遷移和侵襲以及體內轉移。MITA1可促進上皮-間質轉化，這是腫瘤轉移的早期和中心步驟，其機制可能部分歸因于Slug(snail家族鋅指2)轉錄的增加。MITA1缺乏可降低間充質細胞標志物的表達，尤其是Slug，而Slug過表達會顯著削弱MITA1沉默對HCC遷移和侵襲的抑制作用。在HCC組織中，MITA1和Slug前體的水平存在正相關關系。研究顯示，MITA1是HCC轉移的關鍵驅動因素，且已鑒定的AMPK-MITA1-Slug軸可作為HCC的潛在治療策略[18]。

4.3 SNHG10及其同源物SCARNA13 Ma等[18]在64例HCC患者中發現，SNHG10與SCARNA13的表達呈正相關，而SNHG10或SCARNA13的高表達與總體存活率較低有關。SNHG10和SCARNA13協同促成HCC細胞的惡性表型，其中SNHG10充當miR-150-5p的海綿并與RPL4 mRNA相互作用以增加c-Myb的表達和活性。上調和過度活化的c-Myb通過調節SNHG10啟動子活性，形成正反饋環并連續刺激SCARNA13的表達來增強SNHG10和SCARNA13表達[19]。SCARNA13通過調節SOX9介導SNHG10驅動的HCC細胞增殖、侵襲和遷移，并促進HCC細胞的細胞周期和上皮-間質轉化。

4.4 AY927503 AY通過誘導染色質修飾促進HCC轉移。在小鼠中，AY可促進HCC細胞遷移和5-氟尿嘧啶抗性及其轉移。敲低整合素αV(ITGAV)可消除AY導致的HCC細胞遷移，降低HCC細胞的活力。AY通過特異性地與ITGAV啟動子相互作用并刺激其活性，促進ITGAV轉錄和αVβ3表達。AY可與組蛋白1FX(H1FX)相互作用，但AY中央結構域(AYΔ371-522)的缺失使其無法與H1FX結合并刺激ITGAV啟動子。AY顯著富集H3K4Me3和acH3K9/14，但降低了H3K27Me3和H1FX在ITGAV啟動子上的占有率，重塑了RNA聚合酶Ⅱ募集的染色質結構。H1FX基因敲除可阻斷AY刺激的ITGAV轉錄。ITGAV轉錄作為前驅因子，是HCC患者轉移或預后不良的潛在分子標志物[20]。

4.5 ZFAS1 ZFAS1的表達在肝癌合并門靜脈轉移的患者中顯著高于普通肝癌患者，提示其與肝癌轉移密切相關。miR-150通過抑制ZEB1和金屬基質蛋白酶14(MMP14)、16(MMP16)，發揮抑制肝癌細胞入侵的作用。ZFAS1通過與miR-150結合導致其失去了抑制腫瘤活性的作用，促進了肝癌的發展及轉移[21]。

5 與肝癌預后相關的lncRNA

5.1 LINC01554 LINC01554在HCC中頻繁下調，與HCC患者的腫瘤浸潤(P=0.005)、腫瘤大小(P=0.041)、腫瘤分期(P=0.023)和較短的生存期(P=0.035)顯著相關。熒光素酶報告基因測定揭示LINC01554被miR-365a負調控。亞細胞分級分析和RNA FISH揭示了MIHA細胞和HCC臨床樣品中LINC01554的細胞質優勢。LINC01554的異位表達抑制了HCC細胞生長、軟瓊脂中的集落形成、病灶形成以及裸鼠中的腫瘤形成。LINC01554促進泛素介導的PKM2降解并通過抑制Akt/mTOR信號通路，增強了其抑制HCC細胞中的有氧糖酵解代謝的作用。進一步研究發現，LINC01554敲除可有效逆轉其腫瘤抑制作用。有學者認為LINC01554是HCC中的新型腫瘤抑制因子，并揭示了其重編程細胞葡萄糖代謝的潛在分子機制。LINC01554可能作為一種新的預后生物標志物，為HCC治療提供新靶點[22]。

5.2 MBNL3 MBNL3可促進腫瘤發生并與HCC患者預后不良有關。MBNL3敲低幾乎完全消除了HCC的腫瘤發生。轉錄組學分析發現MBNL3可誘導lncRNA-PXN-AS1外顯子4包裹體。缺乏外顯子4的轉錄物與PXN mRNA的編碼序列結合，引起翻譯延伸因子與PXN mRNA的解離，從而抑制PXN mRNA翻譯。相反，含有外顯子4的轉錄物優先結合PXN mRNA的3'非翻譯區，保護PXN mRNA免受miRNA-24-AGO2復合物誘導的降解，從而增加PXN表達[23]。通過誘導包含外顯子4的基因，MBNL3可上調PXN的表達，從而介導MBNL3的促腫瘤發生作用。以上數據顯示了癌胚接合因子、剪接事件和腫瘤發生之間的詳細機制聯系，且提示剪接因子和剪接事件可作為潛在的腫瘤治療靶點。

6 與乙肝感染致肝癌相關的lncRNA

6.1 PCNAP1及PCNA PCNAP1及PCNA能調節HBV復制并促進肝癌發生。研究人員采用CRISPR/Cas9、Southern印跡分析、共聚焦測定等方法，研究PCNAP1在肝癌發生過程中調控miR-154/PCNA/HBV cccDNA信號傳導對HBV復制的影響，發現HBV感染的人肝嵌合體小鼠肝臟中PCNAP1和PCNA的表達水平顯著升高。臨床上，HBV陽性/HBV cccDNA陽性的HCC患者肝臟中PCNAP1和PCNA的mRNA水平明顯升高。PCNA以HBc依賴性方式與HBV cccDNA相互作用。PCNAP1通過海綿狀miR-154靶向PCNA mRNA 3'UTR增強PCNA的表達。在功能上，PCNAP1或PCNA可顯著增強HBV復制并在體外和體內加速HCC的生長。由此可見，PCNAP1可通過調節miR-154/PCNA/HBV cccDNA信號傳導增強HBV的復制，PCNAP1/PCNA信號傳導驅動肝癌的發生，這為PCNAP1促進HBV復制和肝癌發生的機制提供了新見解[24]。

6.2 HUR1 Wang等[25]通過RNA深度測序量化HepG2細胞和HBV轉基因HepG2-4D14細胞中lncRNA的豐度，發現HUR1在HepG2-4D14細胞中顯著上調，HBV編碼的乙型肝炎X蛋白可增強HUR1的轉錄。HUR1過表達可促進細胞增殖，而HUR1敲低則抑制細胞生長。HUR1可與p53相互作用并抑制其對下游基因的轉錄調節，如p21和B細胞淋巴瘤2相關的X蛋白。HBV上調的HUR1通過與p53相互作用阻斷下游基因轉錄來促進細胞增殖和腫瘤發生，表明HUR1在HBV相關的肝細胞癌發展中起重要作用，可能作為肝細胞癌的治療標志物。

總之，lncRNA在肝癌中的作用涉及肝癌發生、轉移及對預后的影響等，最新研究表明其也可用于肝癌的診斷及治療等。本文匯總分析了最近研究較熱的lncRNA分子，但難免存在遺漏之處。目前對于該領域的研究尚處于初級階段，還有大量與肝癌相關的lncRNA未被鑒定，故仍須進一步深入研究，以為肝癌的診治提供新的靶點。