動物源性食品中致病微生物的快速PCR 檢測

崔榮飛，楊 潔，甄 理，張彩云，劉 偉，曹 楠

（1.石家莊市畜產品和獸藥飼料質量檢測中心 050041；2.河北省動物衛生監督所 050000；3.石家莊市藁城區畜牧工作總站 052160）

動物源性食品(Animal Derived Food)是指全部可食用的動物組織、蛋和奶，包括肉類及其制品(含動物臟器)、水生動物產品以及相關副產品等。 隨著人民生活水平日益提高，動物源性食品已成為國民飲食結構中的主要品種和重要營養來源。 我國在全世界范圍內屬于動物源性食品的生產大國和消費大國， 同時動物源性食品的質量安全關系到人民群眾的身體健康， 引起全社會的普遍關注和相關從業者的廣泛研究。 動物源性食品的質量安全問題主要集中在：農獸藥殘留問題、環境污染問題、加工和銷售過程中污染和添加，其中涉及到化學危害和生物危害等。 而在日常食源性疾病中， 由致病微生物引發的食物中毒或其他疾病是全球范圍內食品安全面臨的主要風險， 而動物及動物源性食品是食源性致病微生物的主要攜帶者之一。 因此，科學家和相關從業者一直致力于動物源性食品中致病微生物檢測技術的研究和開發。 傳統上，致病微生物的檢驗方法主要是生物培養及鑒定，操作復雜、周期長、要求微生物實驗室條件進行，遠不能滿足及時準確檢測、高敏感性和特異性的現實需求。 隨著分子生物學技術研究的深入，微生物的分子生物學檢測技術也在不斷發展，其中PCR 技術因其極高的特異性、 靈敏度和可靠性已經廣泛應用于醫學檢驗、 食品檢測及其他與DNA 或RNA 鑒定相關的領域，該方法快速準確，特別適合病原微生物的檢測，尤其是在今年的新冠疫情中全世界廣泛開展的核酸檢測， 展示了快速PCR技術在檢測領域的強大優勢。 本文就動物源性食品中致病微生物的PCR 檢測技術做以簡單概述，拋磚引玉，希望引起更廣泛的思考和研究[1-2]。

1 常規PCR 技術

PCR 即聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction），最早提出于二十世紀八十年代，是一種體外擴增特異性DNA 片段的手段。 其本質上是利用分子生物學技術，在PCR 儀中模仿DNA的天然復制過程，通過特定靶序列設計特異性引物，達到復制某一指定片段的目的。 PCR 反應步驟包括變性、退火（復性）和延伸三個階段，只要在反應體系中提供足夠多的堿基，并重復循環基本過程的這三個步驟，就可以獲得更多的“半保留復制鏈”，每次復制出的新DNA 鏈又作為下次循環的模板，幾個小時內指數性增長，將待擴目的基因擴增至幾百萬倍。 由于在所有細菌中編碼rRNA 的一些基因序列保守性很強，因此可以用PCR 擴增其相應的DNA 片段，以此快速靈敏的檢測動物源性食品中是否存在某種致病菌，應用PCR 技術檢測微生物，首先要提取靶DNA，即通過離心、 過濾或簡單培養的方法從動物源性食品中獲取細菌細胞，然后將細胞裂解，進行核酸純化使其適合進行擴增[2-3]。

由于傳統PCR 技術出現最早，發展到現階段相關技術非常成熟， 相關產品和配套也比較豐富， 是接受度和應用最廣泛的PCR 技術。

2 多重PCR 技術

常規PCR 開始被提出時，單個反應體系只能特異性擴增一段DNA 序列，因此只能檢測單一致病菌。 但實際應用中我們常常需要針對目標被測物檢測多種致病微生物， 多重PCR（multiplex PCR）的出現滿足了這一需求。多重PCR 與常規PCR 原理和反應過程是相同的， 但是該技術通過在一個反應體系中針對不同的DNA 或RNA 序列設計多對特異性引物，通過優化避免幾個序列間的交叉反應和干擾， 實現了一次PCR 反應擴增多條目的DNA 片段，達到單次實驗檢測多種致病微生物的目的。

多重PCR 的優點有：效率高，通過一次PCR 反應擴增多條目的DNA 片段，實現單次實驗檢測多種致病微生物；實用價值更大，檢測工作實際中常需要對一組常見致病微生物進行篩查，或通過單一致病菌的多個特征序列檢測對被測物進行更準確鑒定；成本降低，通過減少測試次數，大幅度節約檢測的時間成本和經濟成本，有利于推廣應用[4]。

多重PCR 技術在致病菌檢測方面的有兩個方向。 一是單次實驗鑒定單一致病菌。 在一個多重PCR 反應體系中真對致病菌選取多個保守序列設計特異性引物， 通過多個特征位點的檢測鑒定提高真確度，減少假陽性。 Kim S 等在臨床上利用多重PCR對沙門氏菌檢驗分型。 藺芳等根據Genbank 中PRV 的gB、gE、TK 基因序列設計并合成引物,對樣品中PRVDNA 進行多重PCR擴增及反應條件優化,快速鑒別豬偽狂犬疫苗毒和野毒。 二是單次實驗檢測多種病原菌。 這種方法具有更廣泛的應用價值，通過單一擴增反應體系中對多種微生物的檢測，達到降低成本、簡化操作又兼顧特異性和高敏性的目的[5]。 熊蘇玥等在2019 年利用多重PCR 對食品中單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7、 沙門氏菌以及霉菌開展同時檢測，5 種致病微生物在20h 內的檢出限均可達到100CFU/25g。 秦文彥等在2018 年通過優化主要影響因子, 研究建立了產黃曲霉毒素真菌及其潛在飼料或食品污染的多重PCR 快速靈敏檢測體系。

3 實時熒光定量PCR 技術

實時熒光定量PCR （qPCR） 于1996 年被提出， 即在一個PCR 反應體系中引入熒光標記物， 讓PCR 技術開始具備定量的能力，堪稱一次技術飛躍。 經過不斷發展，實時熒光定量逐漸成為一種基礎技術手段， 與各種不同的PCR 技術結合發展出各類其他熒光定量PCR 技術，因其特異性更強、不易污染、自動化程度高的優點，得到越來越廣泛的應用。實時熒光定量PCR 通過在反應中加入特異性探針對PCR 產物進行標記跟蹤， 加入的探針攜帶有熒光標記，監控設備檢測熒光標記，既可以實時了解反應過程，也可以更直觀的對產物進行分析，利用專業軟件對擴增結果進行計算，得到樣品中目標被測物的初始濃度，從而實現較為簡便的定量檢測[6]。

熒光定量PCR 有熒光染料摻入法和探針法兩種常用方法。熒光染料摻入法是把過量的熒光染料加入PCR 反應體系中，反應開始前此染料不會發光， 在反應過程中部分熒光染料會特異性地摻入DNA 雙鏈，開始發射熒光信號，隨著反應進程的持續，熒光信號的增加與PCR 產物的擴增同步， 實現對反應進程的監控。 探針法是指在一個PCR 反應體系中加入攜帶有熒光基團的特異性探針， 這個寡核苷酸探針包括一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。 反應開始前，完整探針不向外發射熒光信號，擴增開始后， 探針隨DNA 擴增被同時酶切分解為兩個獨立基團，使報告熒光基團發出的熒光信號無法被淬滅熒光基團吸收，相應的熒光信號就被監控系統接收到，重復這一過程，就能使每一條擴增的DNA 鏈與熒光分子形成一一對應關系，通過觀測熒光信號累積達到實時定量目的[7]。

實時熒光定量PCR 技術經歷了二十多年的發展，已經被廣泛應用于各類傳染性疾病的臨床診斷和療效評價，禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟等動物疫病病原菌和抗體檢測，食源微生物、食品過敏源、轉基因研究等食品安全領域[8]。 何苗等在2016 年使用實時熒光定量PCR 和雙歧桿菌屬及種特異性引物對收集的嬰兒糞便中的雙歧桿菌屬及人體腸道特有的8 個雙歧桿菌菌種進行定性及定量分析。 章沙沙在2016 年設計并優化實時熒光定量PCR 反應體系，建立了沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生性李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌和副溶血弧菌六種食源性致病菌的實時熒光定量PCR 檢測方法， 并通過食品樣品的檢測和傳統方法驗證，證明該方法具有良好的重復性和準確性。

4 環介導等溫擴增反應（LAMP）技術

PCR 方法操作起來較復雜，其對溫度控制的較高要求令試驗過程對儀器和人員都提出較高要求， 不適合基層或現場快速診斷，2000 年日本學者提出了環介導等溫擴增反應(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術。其獨特優勢使得這項技術在短短幾年間被成功應用于多種疾病的檢測中， 如SARS、禽流感、HIV 等。 該技術通過針對目的基因的6 個不同區域，分別設計一對外部引物和一對內部引物進行識別， 極大增加了目的DNA 片段的特異選擇性，降低了交叉反應和干擾率。 LAMP 最大的優勢是整個反應體系在等溫條件(63℃左右)下進行，且反應時間縮短至30～60min[9]。 LAMP 方法的優勢除了高特異性、高靈敏度外，還對操作和儀器設備的要求降低了，因為LAMP 技術不需要傳統PCR 技術中升溫和退火的溫度變化過程， 只需要借助特殊的鏈置換DNA 聚合酶就實現了等溫條件下擴增降低了對昂貴、精密實驗儀器的需求，簡單的控溫水浴鍋或恒溫箱就滿足實驗條件。 LAMP 反應過程產生大量焦磷酸鎂沉淀，這是一種白色副產物，能造成反應體系溶液的渾濁，因此反應結束后即使不經過凝膠電泳，只使用濁度計或肉眼觀察也能夠判斷結果，相較傳統PCR 技術更具有簡便性和易操作性， 是較為理想的快速檢測方法。 LAMP 方法在反應進程中不能開蓋操作，否則易造成氣溶膠污染，導致假陽性結果[10]。

LAMP 技術通過20 年的發展，在醫學診斷、流行病學、食品檢測和獸醫領域都得到了大范圍推廣和廣泛應用。國內在LAMP技術方面的研究起步較晚，黃朱梁等在2015 年針對食品中單核細胞增生李斯特氏菌建立了基于LAMP 技術的實時濁度檢測方法， 該方法對培養的單核細胞增生李斯特氏菌的檢測下限為32CFU/mL,可在60min 內完成擴增反應。 李佳桐等在2014 年根據GenBank 公布的沙門氏菌高度保守的STN 基因序列設計引物，優化和建立了沙門氏菌的LAMP 檢測方法，最低可檢出濃度為101CFU/mL。

5 重組酶介導等溫核酸擴增技術（RAA）技術的應用

近幾年國內出現了一種分子生物學新技術， 即重組酶介導等溫核酸擴增技術 （Recombinase Aided Amplification）， 簡稱RAA。 該技術利用從細菌或真菌中獲得的重組酶，能夠在恒定常溫 （39℃） 條件下實現核酸的快速擴增。 該重組酶首先與引物DNA 緊密結合，以酶和引物的聚合體形式在模板DNA 上進行搜索，當發現完全匹配的互補序列時，反應體系中的單鏈DNA 結合蛋白開始發揮作用，幫助打開模板DNA 的雙鏈結構，然后在DNA 聚合酶的作用下開始序列復制擴增，最終形成新的DNA 雙鏈，通過周期性重復反應過程使擴增產物以指數級增長。 結合熒光即時檢測， 實現5～20min 輸出結果， 靈敏度達到10copies/測試，該方法對環境溫度、操作技能和實驗設備要求更低，具有很大發展優勢。

重組酶介導等溫核酸擴增技術提出的時間較短， 且尚未形成一定應用規模，因此應用實例和相關報道也不多，李婷在2019年針對血吸蟲病診斷的敏感性、特異性及可操作性的需求,基于重組酶介導的等溫擴增技術原理建立日本血吸蟲特異性基因片段RAA 快速檢測方法，初步研究表明,建立的熒光RAA 法可用于血吸蟲不同樣品的檢測，且在保持特異性良好的同時,檢測敏感性較基礎法提高了100 倍。 魏瑩等在2018 年基于RAA 熒光法建立優化了溶血性鏈球菌檢測方法， 并生產了相關快速檢測試劑盒產品。

6 重組酶聚合酶擴增技術（RPA）技術的應用

重組酶聚合酶擴增技術(RPA),因具有比傳統分子及免疫學檢測技術如聚合酶鏈式反應(PCR)、實時熒光定量PCR、酶聯免疫吸附技術(ELISA)等更快速、靈敏、特異、簡便以及實用性強等方面優勢, 現已在一定程度上得到應用。 RPA 反應的最適溫度在37℃～42℃， 無需變性， 在常溫下即可進行。 這無疑能大大加快PCR 的速度。 此外，由于不需要溫控設備，RPA 可以真正實現便攜式的快速核酸檢測。 RPA 既可以擴增DNA 也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA 合成步驟。 RPA 技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA 結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA 聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37℃左右[11]。

重組酶介導等溫核酸擴增技術也是最近幾年開始興起的新技術，目前在國內應用不多，在致病微生物方面的報道更少。 王金鳳在2018 年基于LMhlyA 基因保守序列， 建立并優化了單核細胞增生李斯特氏菌實時熒光RPA 檢測方法；劉立兵在2018 年根據蠟樣芽胞桿菌保守基因16S RNA 設計特異性引物， 建立了可用于食品中低濃度蠟樣芽胞桿菌檢測的real-time RPA 方法。

7 總結

隨著分子生物學的不斷研究， 針對動物源性食品中致病微生物檢測的PCR 方法一定會不斷發展和更新, 并時刻發生著技術進步，回想十年以前，常規PCR 技術還屬于檢測領域的先進技術，現在已經非常普及，更是出現了如LAMP、RAA、RPA 等等溫核酸擴增技術，可以算得上是PCR 技術領域的一次技術革命，伴隨著這次技術浪潮的推進，我們也要與時俱進，努力學習應用新技術，以更具活力的狀態完成我們的檢測任務。