海洋微生物組研究進展

王妍瑩

摘要：海洋中的微生物蘊含著豐富的功能基因資源，對生物技術開發(fā)、新藥合成、環(huán)保、可再生能源等領域的解決方案能提供靈感和方法，隨著國際上對各種不同環(huán)境微生物組研究的開展，海洋微生物組的研究也日漸興盛并取得了一系列的進展。本文將從海洋微生物多樣性、微生物組研究方法、海洋微生物組功能及應用等方面綜述該領域的研究成果。

Abstract： Microorganisms in the ocean contain rich functional genetic resources， which can provide inspiration and methods for solutions in the fields of biotechnology development， new drug synthesis， environmental protection and renewable energy. With the development of the marine microbiome， a series of advances have been made. This article summarizes the research results in this field from the aspects of marine microbial diversity， microbiome research methods， marine microbiome functions and applications.

關鍵詞：海洋微生物組;多樣性;研究方法;應用

Key words： marine microbiome;diversity;research methods;applications

中圖分類號：Q178.53 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1006-4311（2020）01-0219-04

0 ?引言

海洋環(huán)境不同于陸地，是一個獨特的生態(tài)環(huán)境，有高鹽、高滲、高壓、寡營養(yǎng)等特點，某些海域還存在高酸、高堿、缺氧、低溫、高溫、高輻射等特殊條件，與陸地的一些生態(tài)環(huán)境相比微生物的活動并不劇烈，但從海水表面到海底淤泥都存在非常豐富的微生物資源。海洋環(huán)境的復雜性造就了微生物多樣性，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量流動中起重要作用。海洋微生物群落與動物、植物、土壤中的或人體微生物群落有許多不同的特征[1]，其獨特的遺傳特性和適應機制成為基因庫和生物活性物質的重要來源。《全國科技興海規(guī)劃（2016-2020年）》提出要打造海洋產(chǎn)業(yè)的新引擎，整合優(yōu)化海洋藥源生物種質、基因和天然化合物等資源庫建設，發(fā)展產(chǎn)業(yè)需要的海洋藥物篩選評價、海洋醫(yī)藥制備及制劑工藝技術等支撐平臺，加快海洋微生物高通量原位培養(yǎng)新技術的應用，推動發(fā)現(xiàn)新的功能微生物，為海洋生物醫(yī)藥和功能性食品開發(fā)提供持續(xù)的資源保障。創(chuàng)新新型開發(fā)工業(yè)酶制劑、多肽制劑和工具酶產(chǎn)品、海洋微生物疫苗、抗菌、抗蟲綠色獸藥和抑菌防霉制劑這些規(guī)劃的實現(xiàn)離不開對海洋微生物資源的深度挖掘。

海洋微生物組的研究不僅能完善人們對微生物種屬和生命現(xiàn)象的認知，并且對開發(fā)其所蘊含的基因資源、酶資源、天然產(chǎn)物資源及發(fā)展生物技術都具有重大的推動作用。微生物組是指一個特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)中全部微生物及其遺傳信息，包括生物體及基因組。在2017年由劉雙江、趙國屏兩位院士聯(lián)合提出的“中國微生物組計劃”中將海洋微生物組的研究納入發(fā)展規(guī)劃，提出要以微生物組的理念研究揭示海洋微生物的代謝、信號轉導等機制，發(fā)展海洋微生物相關生物技術及大數(shù)據(jù)分析技術[2]。本文將在總結領域研究成果的基礎上，從海洋微生物的多樣性、研究方法、海洋微生物的功能及應用等方面入手，綜述這一領域的研究進展，并對未來發(fā)展進行討論和展望，希望能為該領域的研究人員及有興趣進入該領域的科技人員提供較全面的視野，快速了解行業(yè)發(fā)展趨勢。

1 ?海洋微生物組的研究方法

1.1 微生物培養(yǎng)技術

通過液體培養(yǎng)和平板培養(yǎng)對微生物進行分離、純化和培養(yǎng)操作來獲得微生物是經(jīng)典微生物學研究單一微生物生理生化和遺傳特性的基礎，人們所了解的大部分關于微生物特性的知識基本依賴于對微生物培養(yǎng)水平，雖然目前可培養(yǎng)的微生物大多還不到50%，但是培養(yǎng)仍然是微生物學的基礎。19世紀70年代人們建立無菌操作技術、細菌培養(yǎng)技術和純種分離技術，隨后Zobell最先開展海洋細菌的培養(yǎng)工作[3]，隨著人們對海洋微生物特性和營養(yǎng)類型等的了解不斷深入，開發(fā)出了多種典型培養(yǎng)基，使得越來越多的海洋微生物被分離。冀世奇等人[4]通過活細胞微球包埋技術進行海洋微生物高通量培養(yǎng)和分選獲得了500株菌株，與平板分離獲得的254株菌種進行對比分析，結果表明高通量法獲得了更高的微生物多樣性，并且能培養(yǎng)出平板法不能或不易分離到的類群，提高了微生物的可培養(yǎng)養(yǎng)性。微生物培養(yǎng)的主要策略是盡可能地模仿微生物生存的自然環(huán)境，例如模擬低營養(yǎng)、低氧、高二氧化碳等環(huán)境條件以及在培養(yǎng)環(huán)境中加入自然環(huán)境成分等方法。Connon等人通過模擬極低營養(yǎng)水平的海洋環(huán)境條件對海洋微生物進行高通量篩選獲得了多種海洋新菌種[5]。Kaeberlein等人設計了一個僅對分子有通透性的擴散室，放入含有潮間帶沉積物和海水的水族箱中進行培養(yǎng)，通過模擬自然環(huán)境，使得以前未培養(yǎng)的微生物能在瓊脂培養(yǎng)基中生長，在純培養(yǎng)條件下分離出具有代表性的海洋生物群落[6]。

1.2 免培養(yǎng)技術

人們在采用平板培養(yǎng)微生物時發(fā)現(xiàn)能被培養(yǎng)微生物與環(huán)境微生物實際數(shù)量之間存大巨大差異，這可能是由于人們尚未準確了解環(huán)境微生物的生存條件如pH值、營養(yǎng)需求、代謝類型以及是否與其它微生物間有生存依賴等要求而造成的培養(yǎng)失敗。單純依靠培養(yǎng)技術并不能完全反映海洋微生物多樣性的真實情況，可能造成具有應用潛力的微生物資源被遺漏。多年來人們一方面傾力發(fā)展微生物培養(yǎng)技術，另一方面開辟新徑通過一些免培養(yǎng)策略從系統(tǒng)水平和原位單細胞水平規(guī)避培養(yǎng)難題對微生物進行研究，發(fā)展出了一系列面培養(yǎng)技術用于微生物資源發(fā)掘。例如基于16SrRNA/18SrRNA分析和新一代測序技術的系統(tǒng)分類標記法研究群落組成及結構，利用功能宏基因組學研究群落遺傳潛能，利用宏轉錄組、宏蛋白質組學及代謝組學等技術研究群落的功能、真實的代謝情況及其在藥物和食物成分代謝方面的影響，或是利用單細胞基因組測序及組裝技術結合參考基因組進行同源聚類探究微生物分布特性的原因[7]。總的來說，免培養(yǎng)技術適用于多種環(huán)境中可培養(yǎng)及不可培養(yǎng)微生物的研究，對微生物新種的界定和發(fā)現(xiàn)、評價具有重要生態(tài)地位的種群及發(fā)掘未知微生物中的基因資源和特殊環(huán)境微生物群落的功能資源具有極大的優(yōu)越性。

2 ?海洋微生物資源多樣性

海洋微生物是海洋中個體微小、構造簡單的生物的總稱，包括古生菌、細菌、放線菌、霉菌、酵母、病毒、衣原體、支原體、噬菌體、微型原生動物等。微生物系統(tǒng)學和高通量測序技術的快速發(fā)展促進了研究人員對海洋微生物多樣性的認識。Tara Oceans expedition項目于2009年啟動后，Sunagawa等用宏基因組學技術分析了Tara計劃243個樣品的宏基因組數(shù)據(jù)，生成一個含有4千萬以上非冗余序列的海洋微生物參考基因庫，大多數(shù)新序列主要是來自病毒、原核生物以及微型真核生物[8]，de Vargas等人通過對從熱帶和溫帶海洋中劃分的334個大小不同的有光線區(qū)域中獲取的浮游生物群落樣本的18SrRNA序列分析，對真核生物多樣性進行評估，在目前所有的分類學水平上得到約11200個真核浮洲生物類群[9]。

2.1 海洋古生菌

人們利用DNA序列技術研究原核生物之間的相互關系時發(fā)現(xiàn)了古生菌。海洋中的古生菌常生活在一些極端環(huán)境中，如淺海或深海的厭氧沉積物、熱泉或深海熱液噴口等地方。古菌的分類是16SrRNA序列分析為依據(jù)[10-12]。古菌在海洋中的數(shù)量和種類在不同海域、不同深度分布并不均衡。

2.2 海洋細菌

海洋細菌是海洋微生物中分布最廣、數(shù)量最大的一類生物。幾乎所有已知生理類群的細菌都能在海洋中找到，包括光能和化能自養(yǎng)、異養(yǎng)、好氧及厭氧、寄生和腐生、浮游和附著等類型。海水中的細菌以革蘭氏陰性菌占優(yōu)勢，海底沉積土中以革蘭氏陽性菌占優(yōu)勢。對海洋細菌的研究已發(fā)展到分離菌種、研究群落結構、研究分布規(guī)律及生理生態(tài)功能等深層次。在一項涉及139份富含原核生物的海洋樣本的研究中原核生物種類達到35000種以上，分析顯示垂直分層及上層海洋原核生物群落組成主要受溫度影響[8]。近海區(qū)的細菌密度比遠洋大，表層水和水底泥界面處細菌密度比深層水大，底泥中密度比海水中大，泥土中高于沙土。通過宏基因組測序方法對不同深度海洋的物種和宏基因組功能類群進行研究發(fā)現(xiàn)不同深度位置上細菌的豐度均超過古菌。

2.3 海洋真菌

海洋真菌分布廣泛，從潮間帶到深海、從淺灘到深海沉積物中均有分布。寄主的地理分布范圍、海水溶氧量、水溫是影響海洋真菌分布和發(fā)展的重要環(huán)境因素。海洋真菌采取營腐生或寄生方式生活，根據(jù)其棲生習性可分為木生真菌、寄生藻體真菌、紅樹林真菌、海草真菌、寄生動物體真菌等幾種生態(tài)型。Jones綜合考慮多種因素的影響后估計海洋真菌超過10000種，包括專性/兼性海洋真菌、海洋酵母、深海真菌、海洋動植物內生真菌和沉積物真菌等[13]。

2.4 海洋病毒

海洋是地球上含病毒最多的生態(tài)環(huán)境，海洋病毒的數(shù)量是海洋細胞微生物數(shù)量的10倍左右。海洋病毒具有豐富的多樣性，人們主要采用宏基因組學方法調查研究海洋病毒多樣性。Brum等人使用來自Tara海洋考察項目26個站點的43份樣本的定量雙鏈DNA（dsDNA）病毒片段宏基因組和整個病毒群落的形態(tài)學數(shù)據(jù)集評估了上層海洋的病毒群落模式和結構，并通過對病毒蛋白簇、種群以及形態(tài)學的多方面分析建立了一個全球海洋dsDNA病毒學數(shù)據(jù)庫以解釋海洋病毒群落如何保持高度局部多樣性[14]。Roux等人通過分析近期兩次國際大洋考察采集的表層和深海病毒樣本中的基因組數(shù)據(jù)，鑒定出15222個病毒種群，包括867個病毒簇[15]。

3 ?海洋微生物組的應用

3.1 發(fā)現(xiàn)新種屬，開發(fā)基因資源

古菌域中三大類群之一的初生古菌門是一類至今仍不可培養(yǎng)的超嗜熱古菌，它的分類地位的確定主要是通過對熱泉非培養(yǎng)微生物的16SrRNA進行序列分析。通過高通量測序和宏基因組學等方法發(fā)現(xiàn)海洋中極低豐度微生物和不可培養(yǎng)微生物，功能宏基因組學還有助于開發(fā)具有某種潛能的功能基因資源。Venter等人構建了馬尾藻海表層水樣微生物的宏基因組文庫，通過鳥槍法測序和數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了1800多種新的海洋微生物及1.21×106種新基因，豐富了人們對海洋微生物物種多樣性的認識，為研究海洋代謝潛能提供了大量的信息[16]。Jiao等人從我國東海海底沉積物的宏基因組文庫中獲得了一種新的編碼聚乙酰合成酶的基因[17]。Lee等人[18]構建了韓國西海岸底泥樣品的宏基因組文庫，篩選到一個編碼新型蛋白水解酶的基因，它編碼的酶能水解偶氮酪蛋白和纖維蛋白，可用于血栓治療。

3.2 從海洋微生物中挖掘新型酶資源

海洋環(huán)境復雜，微生物生物化學機能多樣，使得從海洋微生物中獲取的酶也具有極高的生化及生理機能多樣性，加之深海環(huán)境還存在高壓、貧營養(yǎng)、黑暗等不利生命存在的因素，在深海熱液、海底沉積物、海山、深海冷泉等特殊環(huán)境中的微生物，其特殊代謝功能也是發(fā)掘新型酶資源的重要方向。例如從海洋微生物中獲得的能幫助人們規(guī)模化制備海洋活性寡糖的海藻多糖降解酶和遺傳工程中的熱穩(wěn)定性酶。Chu等人[19]采用功能篩選辦法，通過在培養(yǎng)基中添加三丁酸甘油酯和阿拉伯膠作底物，從海洋微生物基因組文庫中篩選到了兩個新的酯酶，一種能在多種二價離子和高濃度NaCl的溶液中有良好活性，另一個能在30%甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中具有較高的穩(wěn)定性，有潛在工業(yè)應用價值。

3.3 開發(fā)海洋新型活性物質

海洋微生物豐富的天然產(chǎn)物結構類型是新型生物活性物質的重要來源。目前人們從海洋中分離到的化合物主要包括肽類、生物堿類、神經(jīng)酰胺、內酯類、醌類、酮類、萜烯類及甾體類等，其中的某些活性物質具有抗腫瘤、抗菌能力。Wang等人發(fā)現(xiàn)深海沉積物中的真菌Acrostalagmus luteoalbus SCSIO F457產(chǎn)生的兩種吲哚二酮哌嗪對四種惡性腫瘤細胞系有抑制作用[20]。Lin等人從1300米深海沉積物樣品中分離到一株對鹵蝦幼蟲具有較強毒性的青霉屬真菌，從其培養(yǎng)物中分離純化了一種新的倍半萜醌類化合物青霉素A，該青霉素A對小鼠黑色素瘤（B16）、人黑色素瘤（A375）和人宮頸癌（Hela）細胞株的體外增殖有一定的抑制作用[21]。

3.4 治理環(huán)境污染

Luo等人通過富集培養(yǎng)從東太平洋深海沉積物中分離出一株能以甲醛為唯一碳源和能源的降解菌，18SrRNA序列分析鑒定其為產(chǎn)黃青霉DY-F2[22]。研究人員可以通過構建污染水域的宏基因組文庫，篩選有降解靶標物質能力的克隆，將其中的功能基因組成能降解污染物的功能基因簇用于分解環(huán)境中的石油烴及其他有毒化合物和重金屬。Tremblay等人利用加拿大西部和東部海岸石油降解潛力微觀實驗中提取的宏基因組和元轉錄組數(shù)據(jù)估計了在分散劑存在下石油降解細菌的基因豐度和活性，發(fā)現(xiàn)原油中添加分散劑主要有利于原油中兩種重要的天然降解菌在夏季和冬季的富集，為分散劑在海洋環(huán)境下的石油泄漏治理中的應用提供支持數(shù)據(jù)[23]。這些研究都為環(huán)境污染的治理提供了新思路。

3.5 研究海洋微生物的生態(tài)功能

海洋細胞微生物因其代謝類型多樣而在生態(tài)系統(tǒng)中扮演多種重要角色，為海洋生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學循環(huán)提供動力。海洋細菌與真核宿主間也存在復雜的關系，共生或致病等，通過生物活性分子調控形成復雜的化學相互作用體系進行化學交流進而改變宿主的生理和群落組成。海洋病毒可以通過影響海洋細胞微生物進而參與并影響生物地球化學過程。Roux等人的研究鑒定出243個病毒編碼的輔助代謝基因，深入分析表明大量的病毒可能直接操控整個海洋表層的氮和硫元素循環(huán)，病毒在海洋生態(tài)系統(tǒng)的元素循環(huán)中可能扮演關鍵角色[15]。為解析深海微生物群落的代謝結構，Acinas分析了 Malaspina Global Expedition全球考察隊取自大西洋、印度洋和太平洋的58份深海微生物樣本的宏基因組，宏基因組組裝發(fā)現(xiàn)了11個潛在的新門并揭示混合營養(yǎng)是深海中廣泛存在的一種營養(yǎng)策略，增加了人們對地球上最大生態(tài)系統(tǒng)的功能多樣性、代謝多樣性和碳循環(huán)的理解[24]。

4 ?討論與展望

全球性的海洋微生物資源考察項目向人們展示了海洋中巨大的新物種和基因資源，2015年間更是有多篇圍繞Tara Oceans expedition項目成果的文章在《Science》上集中發(fā)表[8，9，25-27]，這些研究表明海洋微生物在群落結構、新陳代謝途徑、生理生化反應、代謝產(chǎn)物等方面豐富的多樣性是有巨大潛能的資源寶庫，而微生物組學在研究這個資源寶庫方面具有明顯的優(yōu)勢。近年來人們在“組學”、高通量及大數(shù)據(jù)等技術方面及研究思路方面不斷創(chuàng)新[28]，助力研究復雜的海洋微生物群體生長及代謝將更好地為人類健康及可持續(xù)發(fā)展服力。同時，海洋微生物的有效培養(yǎng)手段的不斷改進是推動海洋微生物組從描述性研究進一步向功能性研究及應用性研究發(fā)展的重要方面。

參考文獻：

[1]Moran M A. The global ocean microbiome[J]. Science， 2015， 350（6266）.

[2]劉雙江，施文元，趙國屏.中國微生物組計劃：機遇與挑戰(zhàn)[J].中國農(nóng)業(yè)文摘-農(nóng)業(yè)工程，2018，30（06）：11-17.

[3]Zobell C E. Marine microbiology. A monograph on hydrobacteriology[M]. City： Chronica Botánica Company， Waltham， Mass.， 1946.

[4]冀世奇.海洋微生物高通量培養(yǎng)和分選技術的建立及應用[D].City：中國海洋大學，2011.

[5]Connon S A， Giovannoni S J. High-throughput methods for culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates[J]. Appl Environ Microbiol， 2002， 68（8）： 3878-3885.

[6]Kaeberlein T， Lewis K， Epstein S S. Isolating "uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment[J]. Science， 2002， 296（5570）： 1127-1129.

[7]Thompson L R， Haroon M F， Shibl A A， et al. Red Sea SAR11 and Prochlorococcus Single-Cell Genomes Reflect Globally Distributed Pangenomes[J]. Appl Environ Microbiol， 2019， 85（13）.

[8]Sunagawa S， Coelho L P， Chaffron S， et al. Structure and function of the global ocean microbiome[J]. Science， 2015， 348（6237）： 1261359.

[9]De Vargas C， Audic S， Henry N， et al. Eukaryotic plankton diversity in the sunlit ocean[J]. Science， 2015， 348（6237）： 1261605.

[10]Lysnes K， Thorseth I H， Steinsbu B O， et al. Microbial community diversity in seafloor basalt from the Arctic spreading ridges[J]. FEMS Microbiol Ecol， 2004， 50（3）： 213-230.

[11]Santelli C M， Edgcomb V P， Bach W， et al. The diversity and abundance of bacteria inhabiting seafloor lavas positively correlate with rock alteration[J]. Environ Microbiol， 2009， 11（1）： 86-98.

[12]Lee M D， Walworth N G， Sylvan J B， et al. Microbial Communities on Seafloor Basalts at Dorado Outcrop Reflect Level of Alteration and Highlight Global Lithic Clades[J]. Front Microbiol， 2015， 6： 1470.

[13]Jones E B G. Fifty years of marine mycology[J]. Fungal Diversity， 2011， 50（1）： 73.

[14]Brum J R， Ignacio-Espinoza J C， Roux S， et al. Patterns and ecological drivers of ocean viral communities[J]. Science， 2015， 348（6237）： 1261498.

[15]Roux S， R. Brum J， E. Dutilh B， et al. Ecogenomics and potential biogeochemical impacts of globally abundant ocean viruses[J]. Nature， 2016， 537.

[16]Venter J C， Remington K， Heidelberg J F， et al. Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea[J]. Science， 2004， 304（5667）： 66-74.

[17]Jiao Y L， Wang L H， Dong X Y， et al. Isolation of new polyketide synthase gene fragments and a partial gene cluster from East China Sea and function analysis of a new acyltransferase[J]. Appl Biochem Biotechnol， 2008， 149（1）： 67-78.

[18]Lee D G， Jeon J H， Jang M K， et al. Screening and characterization of a novel fibrinolytic metalloprotease from a metagenomic library[J]. Biotechnol Lett， 2007， 29（3）： 465-472.

[19]Chu X， He H， Guo C， et al. Identification of two novel esterases from a marine metagenomic library derived from South China Sea[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2008， 80（4）： 615-625.

[20]Wang F-Z， Huang Z， Shi X-F， et al. Cytotoxic indole diketopiperazines from the deep sea-derived fungus Acrostalagmus luteoalbus SCSIO F457[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 2012， 22（23）： 7265-7267.

[21]Lin X， Zhou X， Wang F， et al. A new cytotoxic sesquiterpene quinone produced by Penicillium sp. F00120 isolated from a deep sea sediment sample[J]. Mar Drugs， 2012， 10（1）： 106-115.

[22]Luo J-J， Ding J-F， Li G-W， et al. Characterization of a formaldehyde degrading fungus Penicillium chrysogenum DY-F2 isolated from deep sea sediment[J]. International Biodeterioration & Biodegradation， 2014， 89： 45-49.