卵母細(xì)胞衰老的分子病因?qū)W研究進(jìn)展

李巖，劉玨，劉民*

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京 100191；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院-北京市心肺血管疾病研究所流行病研究室，北京 100029)

女性生殖系統(tǒng)對(duì)女性健康的意義重大，它是女性第一個(gè)衰老的器官系統(tǒng)，比其他一般器官的自然功能老化早大約十年[1]。隨著全球預(yù)期壽命的增加，生殖衰老正在成為一個(gè)重要的健康問(wèn)題。了解卵母細(xì)胞衰老的原因和分子機(jī)制對(duì)于抑制與年齡相關(guān)的疾病和促進(jìn)女性健康長(zhǎng)壽是至關(guān)重要的。人類的卵母細(xì)胞數(shù)量逐漸減少、卵母細(xì)胞質(zhì)量逐漸變差是導(dǎo)致女性生殖衰老的一個(gè)重要因素[1]。本文將從基因組的完整性和穩(wěn)定性、線粒體功能障礙、端粒縮短、DNA損傷修復(fù)、表觀遺傳學(xué)改變、以及神經(jīng)內(nèi)分泌級(jí)聯(lián)反應(yīng)這幾個(gè)方面與卵母細(xì)胞衰老的關(guān)系，對(duì)卵母細(xì)胞衰老的分子病因?qū)W研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、卵母細(xì)胞基因組的不完整性和不穩(wěn)定性導(dǎo)致卵母細(xì)胞衰老

卵母細(xì)胞與體細(xì)胞一樣會(huì)受到內(nèi)源性和外源性因素引起的各種不同類型的DNA損傷，細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的能力對(duì)維持其基因組完整性及正常功能至關(guān)重要。在所有DNA損傷中，DNA雙鏈斷裂因能顯著改變基因的完整性而最為有害。DNA雙鏈斷裂是檢測(cè)人卵母細(xì)胞老化的可靠方法，共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張突變(ATM)介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂是導(dǎo)致人卵母細(xì)胞老化的原因[2]，乳腺癌1型和2型易感蛋白(BRCA1和BRCA2)是ATM介導(dǎo)的DNA損傷信號(hào)通路的重要成員，對(duì)DNA雙鏈斷裂修復(fù)至關(guān)重要[3]。研究顯示，BRCA基因突變的女性卵巢儲(chǔ)備減少、卵巢老化加速、具有過(guò)早自然絕經(jīng)的傾向[4]。BRCA1與RAD51協(xié)同作用，激活RAD51介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)，并且BRCA1參與細(xì)胞周期調(diào)控，是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白激酶2(CHK2)調(diào)節(jié)有絲分裂進(jìn)程的靶點(diǎn)[5]。BRCA1基因突變、p53依賴的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)停止，有絲分裂停滯導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性[6]。如果敲除參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)的主要基因(BRCA1、RAD51、ATM)，卵母細(xì)胞的數(shù)量和存活率顯著降低[2]。

有研究發(fā)現(xiàn)，紡錘體裝配檢查點(diǎn)可以監(jiān)測(cè)姐妹染色單體附著在微管上進(jìn)行有絲分裂的過(guò)程。如果監(jiān)測(cè)失敗會(huì)導(dǎo)致染色體數(shù)目出現(xiàn)非整倍體異常，mad2和bub1是檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)通路的組成部分，其表達(dá)減少會(huì)增加老年婦女卵母細(xì)胞的非整倍體發(fā)生率，導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，有絲分裂著絲粒相關(guān)蛋白(MCAK，一種微管解聚酶)及調(diào)節(jié)其精確定位和活性的極光激酶B(AURKB)表達(dá)減少和定位錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞染色體分離錯(cuò)誤，非整倍體發(fā)生率增加[8]。此外，p53家族成員(p53/p63/p73)是細(xì)胞周期、凋亡和基因組穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)監(jiān)測(cè)人卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p73的表達(dá)水平在老年女性中減弱[9]。這些證據(jù)表明，導(dǎo)致卵母細(xì)胞基因組的不完整性和不穩(wěn)定性的原因是復(fù)雜的，不能歸結(jié)于單一的干擾和機(jī)制，需要幾個(gè)DNA修復(fù)機(jī)制的相互作用，以保護(hù)并調(diào)控卵母細(xì)胞基因組的完整性和穩(wěn)定性。

二、卵母細(xì)胞線粒體功能障礙導(dǎo)致卵母細(xì)胞衰老

線粒體被認(rèn)為是細(xì)胞的能量工廠，卵母細(xì)胞含有大量線粒體，線粒體是卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育的關(guān)鍵[10]。線粒體在有氧代謝產(chǎn)生能量的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)，由于線粒體DNA(mtDNA)位于線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈附近，沒(méi)有組蛋白保護(hù)、抗氧化能力和DNA修復(fù)能力均較低，因此接觸ROS的mtDNA很容易受到損傷，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，mtDNA的拷貝數(shù)可能增加或減少，從而影響線粒體基因組的完整性和穩(wěn)定性[11]。對(duì)人卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞mtDNA的研究發(fā)現(xiàn)，老年女性卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中正常線粒體水平顯著降低[12]。

線粒體功能異常不僅直接影響卵母細(xì)胞，還與卵母細(xì)胞周圍的體細(xì)胞有關(guān)。卵丘細(xì)胞控制線粒體的生物發(fā)生過(guò)程，在卵母細(xì)胞內(nèi)形成足夠的線粒體池，可在卵母細(xì)胞成熟的最后階段向卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)[13]。卵巢老化表現(xiàn)為卵巢儲(chǔ)備下降，影響卵丘細(xì)胞控制線粒體的生物發(fā)生，線粒體功能障礙可能是卵母細(xì)胞質(zhì)量受損的原因[14]。顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中存在一種線粒體生物發(fā)生的調(diào)節(jié)因子sirtuin3，可調(diào)節(jié)其靶點(diǎn)谷氨酸脫氫酶的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢儲(chǔ)備減少的女性的顆粒細(xì)胞中和年齡大于40歲的女性的卵丘細(xì)胞中sirtuin3的表達(dá)減少[15]。盡管mtDNA突變的總體水平較低，但線粒體功能障礙可以加速卵母細(xì)胞的衰老，對(duì)衰老過(guò)程有著重要的影響。

三、端粒縮短引起卵母細(xì)胞衰老

端粒是線性真核染色體末端的一種特殊功能復(fù)合體，覆蓋并保護(hù)染色體末端，防止末端發(fā)生DNA損傷反應(yīng)[16]。端粒縮短是人類細(xì)胞老化的標(biāo)志[17]，端粒酶是一種RNA依賴性DNA聚合酶，可以恢復(fù)縮短的端粒[16]。端粒磨損在卵母細(xì)胞老化過(guò)程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)人成熟卵母細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度明顯短于未成熟卵母細(xì)胞，由于未受精卵母細(xì)胞中沒(méi)有端粒酶活性，因此人成熟卵母細(xì)胞端粒較短的原因可能是卵發(fā)生過(guò)程中進(jìn)行性端粒縮短[18]。由于端粒是具有高G-C含量的重復(fù)DNA序列，因此端粒對(duì)ROS高度敏感，即使是在卵母細(xì)胞這類非分化細(xì)胞中，氧化應(yīng)激也可以導(dǎo)致卵母細(xì)胞端粒縮短[19]。研究顯示極短端粒可以觸發(fā)p53依賴性細(xì)胞周期停滯導(dǎo)致DNA損傷，激活細(xì)胞衰老途徑[20]。通過(guò)研究原發(fā)性卵巢功能不全的女性顆粒細(xì)胞的端粒酶活性較低、端粒較短，說(shuō)明端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度可以作為卵巢功能不全的分子標(biāo)記物[21]。基于這些證據(jù)可知，卵母細(xì)胞的正常衰老伴隨著端粒磨損，病理性端粒縮短會(huì)加速卵母細(xì)胞的老化，但有關(guān)激活端粒酶能否逆轉(zhuǎn)卵母細(xì)胞衰老的證據(jù)尚不充分。

四、p53介導(dǎo)的卵母細(xì)胞凋亡

p53蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，在DNA損傷后的修復(fù)過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，p53被激活后調(diào)控關(guān)鍵過(guò)程包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期停滯、衰老和凋亡[22]。p53通過(guò)激活p21的轉(zhuǎn)錄，引起DNA損傷后細(xì)胞周期停滯，并且通過(guò)激活下游靶基因來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和凋亡[22]。許多研究未能在卵母細(xì)胞中檢測(cè)到p53，但p53同系物p63[23]的一種亞型tap63α在未成熟的卵母細(xì)胞核中被檢測(cè)到高水平表達(dá)[24]。DNA損傷誘導(dǎo)p63磷酸化并導(dǎo)致其與p53同源的DNA位點(diǎn)結(jié)合，這與卵母細(xì)胞死亡有關(guān)[24]。TAP63α代表對(duì)未成熟卵母細(xì)胞DNA損傷的特異性應(yīng)答，其對(duì)于監(jiān)測(cè)女性生殖系的完整性至關(guān)重要[25]。

五、卵母細(xì)胞衰老的表觀遺傳學(xué)改變

表觀遺傳通過(guò)改變?nèi)旧w構(gòu)象而不是改變DNA序列來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并充當(dāng)連接內(nèi)外信號(hào)橋梁的作用[26]。最常見的表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA，這些表觀遺傳變化在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞衰老過(guò)程中發(fā)揮特殊的作用[27]。盡管如此，由于研究所涉及的細(xì)胞類型的敏感性，許多與卵母細(xì)胞衰老有關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究多是在小鼠卵母細(xì)胞上進(jìn)行，對(duì)人類卵母細(xì)胞老化的表觀遺傳學(xué)我們卻知之甚少。

1.DAN甲基化：DNA甲基化是最具特征的表觀遺傳修飾，涉及轉(zhuǎn)錄抑制、X染色體失活以及基因組印記。它是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(dnmts)的作用下，基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)，富含CpG的區(qū)域，稱為CpG島[28]。有研究顯示，p53家族的三個(gè)成員(p53/p63/p73)在卵母細(xì)胞衰老過(guò)程中具有潛在作用，其中p73基因編碼兩種主要的蛋白質(zhì)亞型(TAp73和ΔNp73)。在人類中，受DNA甲基化模式調(diào)節(jié)的TAp73在38歲以上女性的卵母細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于36歲以下女性的卵母細(xì)胞[9]。但目前還沒(méi)有直接的證據(jù)證明人類卵母細(xì)胞中的DNA甲基化狀態(tài)受到老化的影響。

另外，DNA甲基化也可以發(fā)生在CpG之外，被稱為非CpG甲基化或不對(duì)稱甲基化。近期有研究采用單細(xì)胞全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，非CpG甲基化在人卵母細(xì)胞DNA中尤其豐富，隨著卵母細(xì)胞的成熟，基因組中的非CpG甲基化逐漸積累，但非CpG甲基化在特定細(xì)胞類型中發(fā)揮的生物學(xué)作用仍有待研究，未來(lái)對(duì)與人卵母細(xì)胞成熟相關(guān)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化的研究將有助于闡明非CpG甲基化在人卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中所起的生理作用[29]。

2.組蛋白修飾：盡管DNA甲基化是最容易理解的表觀遺傳標(biāo)記，但它與其他表觀遺傳標(biāo)記之間存在關(guān)聯(lián)，如組蛋白修飾[30]。組蛋白修飾，包括甲基化、乙酰化、泛素化和其他修飾，是另一個(gè)重要的表觀遺傳修飾。研究表明，年齡的增加不僅改變?nèi)寺涯讣?xì)胞的甲基化模式，也改變?nèi)寺涯讣?xì)胞的組蛋白乙酰化。組蛋白4不同溶血素(h4k5、h4k8、h4k12和h4k16)的乙酰化在細(xì)胞分裂生發(fā)泡(GV)階段的人卵母細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，而在MⅠ和MⅡ階段的人卵母細(xì)胞中四種組蛋白4賴氨酸的去乙酰化比例不同[31]。這項(xiàng)研究還表明，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中有缺陷的組蛋白去乙酰化隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，在高齡婦女的卵母細(xì)胞中觀察到h4k12乙酰化增加，高齡對(duì)女性MⅡ期卵母細(xì)胞中h4k12去乙酰化有負(fù)面影響[31]。

此外，組蛋白泛素化也受到人卵母細(xì)胞老化的影響，隨著年齡的增長(zhǎng)，組蛋白泛素化減少。通過(guò)比較37～39歲婦女與小于36歲婦女在細(xì)胞分裂中期(MⅡ)卵母細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)泛素化等生物學(xué)過(guò)程與卵母細(xì)胞衰老相關(guān)[32]。對(duì)于37～39歲的女性，卵母細(xì)胞中的泛素1(一種泛素樣蛋白)的基因下調(diào)，但泛素特異性肽酶USP2、USP34和USP42的三個(gè)基因上調(diào)[32]。這表明，人類卵母細(xì)胞的衰老可能影響泛素化。有研究表明老年女性顆粒細(xì)胞低氧會(huì)產(chǎn)生ROS，引起氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞自噬，低氧是卵巢衰老和卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的主要原因[33]。缺氧導(dǎo)致介導(dǎo)DNA損傷信號(hào)通路的BRCA1蛋白啟動(dòng)子的H3K4甲基化降低，H3K9甲基化增加，同時(shí)H3K9乙酰化降低[34]。這些結(jié)果也為卵母細(xì)胞衰老相關(guān)的表觀遺傳改變提供了證據(jù)。

3.非編碼RNA：除了DNA甲基化和組蛋白修飾，基于非編碼RNA(如microRNA)的表觀遺傳修飾也是重要的表觀遺傳機(jī)制。小的非編碼RNA分子稱為microRNA，通過(guò)序列特異性相互作用與靶mRNA特異性結(jié)合，抑制翻譯或降解靶mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯[35]。

在人類MⅡ期卵母細(xì)胞和周圍的卵丘細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)含有豐富的microRNA，它們可能在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間相互關(guān)系中發(fā)揮作用[36]。對(duì)女性MⅡ期卵母細(xì)胞中表達(dá)的microRNA的研究，發(fā)現(xiàn)12個(gè)microRNA參與人卵母細(xì)胞老化過(guò)程的調(diào)節(jié)，其中3個(gè)microRNA(let-7b-5p、miR-19a-3p和miR-519d-3p)表達(dá)水平下調(diào)，9個(gè)microRNA(let-7e-5p、miR-29a-3p、miR-126-3p、miR-136-5p、miR-192-5p、miR-203a-3p、miR-371-3p、miR-484和miR-494-3p)表達(dá)水平上調(diào)[37]。隨著女性年齡的增長(zhǎng)，卵巢儲(chǔ)備減少，這與microRNA及其他非編碼RNA相關(guān)，卵母細(xì)胞質(zhì)量隨年齡的變化可能受microRNA及其他非編碼RNA調(diào)節(jié)[38]。在年齡大于38歲的婦女的卵泡液中的microRNA的表達(dá)譜與年齡小于31歲的婦女明顯不同，4種microRNA的表達(dá)存在差異，其中一些microRNA的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)明顯富含參與硫酸肝素生物合成、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、碳水化合物消化吸收、p53信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞因子-受體相互作用的基因，其中一些途徑已被報(bào)道是女性生殖衰老的決定因素[39]。此外，多囊卵巢綜合征或卵巢早衰患者的卵泡液中的microRNA表達(dá)譜與正常人的卵泡液中的microRNA表達(dá)譜不同[40]。早發(fā)性卵巢功能不全(POI)是女性生殖衰老的一種極端表型[41]，有研究利用microRNA和mRNA微陣列芯片檢測(cè)POI患者顆粒細(xì)胞中的分子標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)miR-379-5p明顯上調(diào)，其通過(guò)直接靶向PARP1和XRCC6抑制細(xì)胞增殖并損害DNA修復(fù)功能，證實(shí)DNA修復(fù)途徑對(duì)POI的意義，并提出該病的表觀遺傳學(xué)解釋[42]。

六、神經(jīng)內(nèi)分泌級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的女性卵巢衰老

人體營(yíng)養(yǎng)軸由垂體前葉產(chǎn)生的生長(zhǎng)激素(GH)及生長(zhǎng)介質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)組成，IGF-I是細(xì)胞對(duì)GH的反應(yīng)繼發(fā)產(chǎn)生的。IGF-I的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路與胰島素誘導(dǎo)的信號(hào)通路相同，因此被稱為“胰島素和IGF-I信號(hào)傳導(dǎo)通路”，是進(jìn)化過(guò)程中最保守的衰老控制通路[43]。在人類卵巢中，IGF-II主要由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，而IGF-I則在卵泡膜細(xì)胞表達(dá)[44]。卵泡膜細(xì)胞是女性產(chǎn)生維持卵泡生長(zhǎng)的激素的關(guān)鍵，卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生雄激素，顆粒細(xì)胞將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，隨后顆粒細(xì)胞源性雌激素又反饋調(diào)節(jié)卵泡膜細(xì)胞[45]。隨著女性年齡的增長(zhǎng)，雄激素產(chǎn)生的減少會(huì)導(dǎo)致老化卵巢竇狀卵泡對(duì)促卵泡激素(FSH)的反應(yīng)降低，并且具有IGF-I介導(dǎo)或增強(qiáng)的作用[46]。

七、總結(jié)與展望

綜上所述，卵母細(xì)胞衰老的分子機(jī)制非常復(fù)雜，由于人卵母細(xì)胞作為研究材料獲取的限制，卵母細(xì)胞老化的分子病因?qū)W研究的直接證據(jù)仍是有限的。盡管如此，目前的發(fā)現(xiàn)對(duì)我們從分子層面理解卵母細(xì)胞衰老的規(guī)律提供了一些關(guān)鍵的提示性線索：首先，越來(lái)越多的證據(jù)表明端粒和端粒長(zhǎng)度與人類生殖衰老密切相關(guān)，關(guān)注端粒長(zhǎng)度作為卵母細(xì)胞衰老的標(biāo)志，研究其在多囊卵巢綜合征、卵巢早衰和子宮內(nèi)膜異位癥中的作用，使得端粒生物學(xué)正在成為女性生殖衰老領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。其次，深入了解卵母細(xì)胞的基因組結(jié)構(gòu)、對(duì)DNA損傷的易感性和DNA修復(fù)機(jī)制的差異對(duì)研究卵母細(xì)胞衰老的規(guī)律也是至關(guān)重要的。最后，microRNA及其靶點(diǎn)也在卵母細(xì)胞衰老相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用，可為疾病的診斷和治療提供新的策略。