熱休克蛋白47與哺乳動物生殖

高輝，王藝琛，張昌軍，刁紅錄，4*

(1.十堰市人民醫院(湖北醫藥學院附屬人民醫院)生殖醫學中心，十堰 442000；2.湖北醫藥學院生物醫藥研究院，十堰 442000；3.湖北省生殖醫學臨床醫學研究中心，十堰 442000；4.湖北醫藥學院生物醫學工程學院，十堰 442000)

一、概述

膠原蛋白是動物體內最豐富的結構蛋白，由28個已知成員組成。作為細胞外基質的主要成分，通過形成纖維或者網狀結構存在動物體的各個組織之中。此外，膠原蛋白與細胞表面受體、基質金屬蛋白酶等多種蛋白相互作用，參與細胞粘附、增殖、細胞外基質調控等過程，對于維持生物體的結構和功能的完整性具有十分重要的意義[1]。熱休克蛋白47(Heat shock protein 47，HSP47)是定位在內質網上參與膠原蛋白生物合成過程的一個重要的分子伴侶，可與三螺旋膠原蛋白短暫而專一的結合，以穩定其構象促進其成熟；由SERPINH1基因編碼，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine proteinase inhibitors，Serpin)超家族，具有與Serpin相同的分子折疊構象，但并不具有絲氨酸蛋白酶抑制活性[2]。

1.HSP47與膠原蛋白成熟：膠原蛋白是由三個肽鏈組成的右手三螺旋結構，肽鏈采用左旋聚脯氨酸Ⅱ型構象，并通過鏈間氫鍵連接在一起，是由三個超過300不間斷的重復Gly-Xaa-Yaa三聯體的α-肽鏈構成[1]。目前對于HSP47作為膠原蛋白特異性分子伴侶的功能主要存在兩種假說：一種是通過穩定熱不穩定的三螺旋折疊中間體來促進前膠原蛋白的折疊，另一種是抑制前膠原蛋白在內質網中的聚集或側聯[3]。HSP47和膠原蛋白的結合與pH值、重力、特異性氨基酸序列等因素相關。

HSP47是哺乳動物細胞內質網中唯一的熱誘導伴侶蛋白。熱休克時，熱休克因子1與位于HSP47轉錄起始位點180 bp處的熱休克元件結合，激活HSP47 mRNA的轉錄[4]。Hsp47基因敲除的小鼠胚胎中建立的成纖維細胞在37℃培養時，細胞內的前膠原蛋白的生物合成出現各種缺陷。降低培養溫度如33℃，膠原蛋白合成恢復正常。說明了HSP47可以穩定熱不穩定的三重螺旋折疊中間體來促進前膠原蛋白的折疊[3]。

當pH值呈中性條件下，HSP47和內質網上的前膠原蛋白短暫的結合，在順式高爾基體或內質網-高爾基體中間間隔室中，pH值變成酸性，HSP47和前膠原蛋白分離，然后通過HSP47的RDEL保留序列被運輸回內質網內，HSP47的組氨酸殘基參與了這種pH值依賴性釋放機制[5]。三螺旋前膠原分子與HSP47一起通過大被膜蛋白復合物II(Coat protein complex II，COPII)從內質網運輸到高爾基體，其中TANGO1參與了復合物的形成[6]。HSP47與ER中的三螺旋前膠原內的膠原(Gly-Xaa-Arg)重復序列結合，并且可以防止其局部解折疊或聚集體形成，從而加速前膠原的三螺旋形成，這種抑制也具有pH值依賴性[7]。HSP47和膠原蛋白之間的相互作用是由膠原蛋白Gly-Xaa-Arg-Gly基序中的Arg殘基和HSP47保守的Asp385殘基之間形成的一個關鍵鹽橋所建立的[8]。HSP47 mRNA的表達與重力的變化具有相關性[9]。缺乏HSP47的細胞，膠原蛋白分泌速率慢，且較容易被蛋白酶消化[10]。

2.HSP47與內質網應激和高爾基體應激：內質網相關降解(ER-associated degradation，ERAD)和未折疊蛋白反應(Unfolded protein response，UPR)是細胞內兩個關鍵的質量控制機制[11]。持續的內質網應激狀態常導致細胞凋亡。HSP47通過與免疫球蛋白結合蛋白競爭和肌醇酶1α的結合促進肌醇酶1α的激活從而減小內質網應激的發生[12-13]。在缺乏HSP47的細胞中積聚在內質網的錯誤折疊的前膠原蛋白會被自噬系統所清除[14]。

蛋白質分泌大量增加可導致高爾基體功能不足，會激活高爾基體應激反應。HSP47保護高爾基體免受O-糖基化抑制的影響，而抑制O-糖基化來干擾糖蛋白轉運是激活高爾基體應激反應的有效刺激因素[15]。在HSP47敲除的細胞中誘導高爾基體應激的發生會導致細胞死亡，同時高爾基保留型凋亡蛋白酶-2的裂解增加和線粒體凋亡蛋白酶-9的激活，以及高爾基反應的誘導也會引起UPR反應[15-17]。

3.HSP47組織特異性表達：HSP47和Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白之間具有時間和空間的相關性，僅在產生膠原蛋白的組織細胞中表達，在不生產膠原蛋白細胞中不表達，HSP47的表達的上升或者下調總是伴隨著各種類型膠原蛋白表達變化而改變[14，18]。HSP47還可與修飾蛋白、纖維調節蛋白和層粘連蛋白結合構成細胞外基質，并參與其分泌[19]。目前鑒定出的HSP47的13個最常見錯義突變為Ser76Trp、Arg103Cys、Arg116Cys、Ser159Phe、Arg167Cys、Arg280Cys、Trp293Cys、Gly323Trp、Arg339Cys、Arg373Cys、Arg377Cys、Ser399Phe和Arg405Cys，其中以精氨酸和半胱氨酸變化為主。這些發現將有助于評估HSP47在膠原蛋白錯誤折疊和人類疾病中的作用[20]。光激活的HSP47在病變狀態細胞中，可根據需要促進膠原合成，并具有時空分辨率，可以為組織再生等領域提供新的治療思路[21]。

綜上所述，HSP47通過增加前膠原蛋白三螺旋結構的穩定性從而促進膠原蛋白的成熟，其與膠原蛋白的結合還與pH值、重力、特異性氨基酸序列等因素相關。在生物體內HSP47可以減小內質網應激和高爾基體應激給細胞帶來的損傷。HSP47的表達具有組織特異性，只在表達膠原蛋白的組織或細胞中表達。目前研究發現HSP47對于哺乳動物生殖的胚胎發育、器官分化、性腺和胎膜正常功能以及生殖系統腫瘤等方面都密切相關，下文將逐一介紹。

二、HSP47與哺乳動物生殖

哺乳動物生殖包括配子成熟、受精卵結合后在母體子宮發育成胎兒并從母體分娩的連續復雜的動態生物學過程。任何一個環節都與膠原蛋白正確的生物學結構和功能息息相關，HSP47的表達異常會造成膠原蛋白的結構缺陷和穩定性受損，從而影響哺乳動物生殖過程的正常進行，造成胚胎發育、細胞分化、性腺和胎膜正常功能等方面的異常。因此HSP47正常有序的表達對于哺乳動物生殖具有至關重要的作用。

1.HSP47與胚胎發育：胚胎發育是指從受精卵分裂分化發育為完整個體的生物學過程，HSP47在早期胚胎的發育過程有重要作用。Hsp47基因敲除小鼠的胚胎存活不超過交配后(Days postcoitum，dpc)11.5天，在9.5 dpc可觀察到胚胎基底膜發生間斷性的斷裂，內臟內胚層的細胞形態紊亂以及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原的含量也明顯減少，電鏡顯示Ⅳ型膠原積聚在擴張的內質網中；在10.5 dpc胚胎體型比野生型要小，體節細胞的數量較野生型少，同時幾乎無法檢測到Ⅰ型膠原蛋白的表達；在10.5～11.5 dpc的胚胎幾乎檢測不到Ⅳ型膠原蛋白和αα鏈的存在，雖然在有的胚胎中存在基底膜樣的結構，但是它們的超微結構異常[7，10]。HSP47的缺失導致膠原蛋白合成發生異常，折疊錯誤的膠原蛋白在內質網中的積累引起的內質網應激，上調調亡標志物CHOP的表達誘導胚胎發生細胞凋亡，是Hsp47基因敲除小鼠胚胎的死亡的重要原因之一[22]。綜上所述，HSP47對于小鼠胚胎的基底膜的正常結構、內臟內胚層的正常形態的維持至關重要。

Masuda等[23]通過免疫組化來檢測HSP47在小鼠胚胎發育過程中的表達，發現HSP47在小鼠胚胎發育分化階段的表達開始于7.5 dpc，主要表達在中胚層和來自中胚層的組織如連接組織、軟骨、脊索、體節等，在神經脊間質(發育板、喉、面部中胚層)、中樞神經系統發育過程中的一些細胞增殖區域(如脈絡膜叢、神經管的腹側)、外胚層的腦室的腹側、室管膜細胞、胃腸道上皮、肝實質細胞下的間葉組織、心臟的肉墊組織以及心內膜組織也可以檢測到HSP47的表達。HSP47對于軟骨發育和正常的軟骨內骨形成是必不可少的。利用Hsp47-flox小鼠和攜帶軟骨細胞特異性Col2a1-Cre轉基因小鼠雜交，在軟骨細胞中條件性地敲除Hsp47基因，小鼠在出生前或出生后不久死亡，并表現出嚴重的廣泛性軟骨發育不良和骨骼畸形，骨骼染色顯示骶骨椎體未見鈣化區，軟骨內骨嚴重扭曲和縮短，Ⅱ型和Ⅺ型膠原水平較低，Ⅰ型膠原分子在椎間盤中堆積錯位，Ⅱ型膠原纖維大量減少[24]。在胰島素樣生長因子II mRNA結合蛋白1(IMP1)基因敲除的小鼠表現出腸絨毛小而畸形和結腸隱窩扭曲，同時HSP47表達下降，表明IMP1與HSP47可能通過調控細胞外基質的形成促進小鼠胚胎發育過程中腸道形態的形成[25]。HSP47在胚胎發育早期的眼組織中強烈表達，分布在間充質細胞(角膜基質、鞏膜和脈絡膜)和透明血管中，在眼發育過程中表達下調，直到產后14 d[26]。綜上所述，HSP47在小鼠胚胎發育早期表達，主要表達在中胚層、神經脊間質、外胚層的腦室的腹側等組織，在軟骨、腸道、眼等器官發生過程中，HSP47也起到重要的生物學作用。

2.HSP47與細胞分化：HSP47在胚胎干細胞(Embryonic stem cells，EMS)向血管平滑肌細胞(Smooth muscle cells，SMC)分化的過程中高度表達，HSP47的缺失會導致分化的減弱。在沒有外源性刺激的情況下，HSP47的過表達也可以誘導ESC向SMC的分化，可能是通過上調趨化因子受體來實現的[27]。目前認為HSP47不直接作用于趨化因子，但HSP47是Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白成熟的分子伴侶，Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白可以通過整合素(α1/β1/αV)信號轉導來誘導ESC的SMC分化[28]，所以HSP47可能是通過增加膠原蛋白的產生和分泌而促進ESC的SMC分化[27]。非鈣依賴性的多功能蛋白S100A4和HSP47結合可以改變HSP47與膠原蛋白結合的氨基酸的電荷，與HSP47競爭和膠原蛋白的結合，誘導細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)和基底膜的重塑，進一步改善細胞分化的微環境，從而調節骨膜細胞的分化[29]。綜上所述，HSP47具有促進細胞分化的作用，可以促進EMS向SMC的分化，以及與S100A4結合調節骨膜細胞分化的過程。因此進一步研究HSP47在細胞分化方面的功能，對于操縱干細胞向目標組織細胞的分化具有重要的意義，為干細胞治療提供新的思路。

3.HSP47與性腺功能：性腺是產生配子的地方，同時也是重要的內分泌器官。在小鼠性腺發育的過程中，HSP47具有十分重要的意義。在睪丸和卵巢中HSP47和XXVI型膠原具有相互作用關系[30]：XXVI型膠原在出生第1天小鼠睪丸中表達較高，之后逐漸減少，在第5天時發現只表達在肌樣細胞；在睪丸間質細胞、睪丸支持細胞以及精原細胞都沒有表達；XXVI型膠原在出生2周以內的小鼠的卵巢中表達較高，之后也逐漸減少；在第7天的小鼠卵巢中，XXVI型膠原表達在初級卵泡周圍的前卵泡膜細胞以及卵巢髓質和皮質的細胞外基質區域，但初級卵泡細胞中沒有表達。目前關于HSP47與XXVI型膠原相互作用機制以及HSP47在睪丸和卵巢的發育過程中的具體作用還需要進一步研究。

《國家中長期教育改革和發展規劃綱要（2010—2020年）》明確指出：“信息技術對教育發展具有革命性影響，必須予以高度重視。”這充分說明教育信息化對現代教育的重要意義。很多一線教師給予信息技術高度關注，肯定了信息技術帶給教學的諸多便利。但是通過訪談和實地調研發現，有些教師在觀念上存在問題，習慣于使用傳統的教學方式進行教學；部分教師認為能熟練操作一些基本軟件、能從網上下載需要的教學資源，就是擁有信息技術教學能力。現在很多學校信息化教學設備資源得到快速發展，但由于教師的應用能力明顯滯后于軟硬件的發展，導致信息技術應用效果沒有達到預期目的。是否還有其他因素在影響教師應用信息技術輔助教學，值得研究。

在甲狀腺功能減退的卵巢中，HSP47表達增加，I和Ⅲ型前膠原蛋白的表達也增加，可以彌補卵巢組織因甲狀腺功能減退(甲減)所造成的ECM的降解，代償甲減所帶來的卵巢功能的損傷[31]。糖尿病患者常出現男性勃起功能障礙。鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠模型與正常大鼠相比，HSP47在糖尿病模型大鼠的陰莖表達顯著降低，表明HSP47可能在糖尿病男性患者勃起障礙中發揮重要作用[32]。

綜上所述，HSP47在睪丸和卵巢的發育過程中均表達，但其具體作用機制需進一步研究。在臨床中，HSP47在甲減患者的卵巢中表達增高，其具有一定代償作用。糖尿病患者陰莖組織中HSP47表達降低，表明HSP47與其勃起障礙具有一定的關系。

4.HSP47與胎膜功能：胎膜是胚胎生長發育必不可少的輔助器官。在妊娠早期，胚胎懸浮于子宮腔內，當其發育至胚泡階段開始伸展，在此期間，胎膜開始形成并向外生長。胎膜起著保護胎兒并從母體獲取營養物質、排出廢物和提供水環境的作用。有研究發現，在非洲人和非裔美國人中攜帶有HSP47的656小T等位基因的頻率高于歐洲裔美國人，其攜帶者易在妊娠期出現早產胎膜破裂(Preterm premature rupture of membranes，PPROM)；PPROM的胎膜膠原蛋白和HSP47表達都降低，這與HSP47的656等位基因有關[33-34]。HSP47基因啟動子中的SNP區域可以降低細胞的啟動子功能，與HSP47的主要656 C等位基因相比，656 T等位基因具有較低的啟動子活性[35]。攜帶HSP47 656 T等位基因的羊膜細胞中的HSP47表達減少，從而減少間質中膠原蛋白合成，使得羊膜的拉伸程度減弱。而羊膜成纖維細胞中HSP47的主要656 C等位基因會使纖維膠原聚集從而使得羊膜具有較大的拉伸強度[33-34]。有研究發現當在HSP47啟動子區的12-bp片段出現缺失時，這會增加啟動子活性，并且能減輕656 T等位基因對PPROM的影響[36]。

子宮肌層ECM重組對于分娩時同步宮縮，胎膜正常功能和宮頸成熟十分重要。肥胖的產婦瘦素水平升高，抑制脂多糖誘導的肌層ECM重塑的能力，與HSP47表達的增加以及基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP2)和MMP9活性和表達的降低有關[37]。

綜上所述，攜帶HSP47 656C等位基因的孕婦其胎膜具有更強的拉伸力度，而656T等位基因具有較低的啟動子活性，其胎膜拉伸強度較低更容易發生PPROM，但是HSP47啟動子區的12-bp片段出現缺失能減輕656T等位基因對PPROM的影響。肥胖孕婦體內瘦素水平較高，HSP47表達增強，其子宮肌層重塑能力減弱，具有較高的分娩風險。

三、HSP47和女性生殖系統腫瘤

HSP47蛋白由SERPINH1基因編碼，該基因位于染色體11q13.5上，該基因是人類癌癥中最頻繁擴增的區域之一[14]。miRNAs(microRNAs)是一大類長度為19～23 bp非編碼的單鏈RNA，這些單鏈miRNA結合目標基因3′非翻譯區UTR上的互補位點，使得mRNA降解和翻譯抑制調節轉錄后基因表達，從而參與生物過程，包括細胞分化、增殖、凋亡和轉移[38]。HSP47在宮頸癌腫瘤組織和宮頸上皮內瘤變中表達上調；在宮頸癌中，miR29與HSP47的表達具有相關性，miR-29抑制HSP47的表達，miR-29的下調導致HSP47的上調。miR-29可以誘導宮頸鱗狀癌細胞凋亡，抑制宮頸癌癌細胞的增殖和侵襲[39]。

綜上所述，miR29與HSP47的表達具有相關性，在宮頸癌中HSP47表達上調，但miR-29可以誘導宮頸鱗狀癌細胞凋亡，抑制宮頸癌癌細胞的增殖和侵襲。在乳腺癌中HSP47的表達增加以及miR-29b和-29c表達降低，HSP47受TGF-β通路的調控，HSP47與DDR2、NMIIA的相互作用會增強癌細胞的遷移和侵襲。

四、結語

優生優育是目前國家重點規劃之一，健康寶寶的出生不僅需要良好的胚胎，更需要一個健康的母體為其提供好的“土壤”。HSP47是絲氨酸蛋白酶抑制劑中一個重要的熱休克蛋白，它對膠原蛋白的成熟有著十分重要的意義。目前研究發現HSP47在胚胎發育、器官發生、細胞分化、性腺和胎膜的正常功能以及女性生殖系統腫瘤中有著不可或缺的作用。進一步研究HSP47在哺乳動物生殖過程中的調控作用，將對闡明不孕不育的病因、胚胎發育異常的分子基礎有重要意義。同時，對提高輔助生殖技術的體外胚胎培養的胚胎生存率和優生優育都具有重要意義。