納米羥基磷灰石抗腫瘤作用的研究進展

何佳穎 張雨凇 覃文聘 牛麗娜 焦 凱

癌癥是威脅全球公共健康的主要原因之一，其發生率還在持續增加，每年新增病例超過1000萬例[1]。目前，癌癥的常規治療僅限于化療、放療和手術。然而化療和放療往往對正常細胞有嚴重的不良反應。手術雖可以完全切除原發腫瘤和可見的轉移，但腫瘤通過微轉移侵襲鄰近組織或擴散到遠處組織往往限制了其療效[2]。近年來，基于羥基磷灰石性質的研究飛速發展，人們發現羥基磷灰石納米顆粒(hydroxyapatite nanoparticle，nHAP)可以負載基因、蛋白、藥物等進入細胞內部，從而影響細胞的分化以及基因的表達[3]。此外，nHAP本身也具有抑制腫瘤細胞增殖和轉移的作用。與傳統的化療比較，使用nHAP治療可以有效地抑制腫瘤的增殖和轉移，而不會損傷正常細胞，為腫瘤治療做出了巨大貢獻。然而，亦有文獻指出，一定濃度的nHAP可促進癌細胞轉移并促進其惡性潛能[4]。

因此，本文從nHAP對腫瘤細胞超微結構和功能的影響、nHAP形成礦化膠原纖維防止腫瘤侵襲展開綜述，并對nHAP促進癌細胞轉移及其惡性潛能的風險加以分析，為nHAP在腫瘤治療領域中的應用提供參考和借鑒。

一、nHAP

1.nHAP概況:HAP是一種天然的磷灰石礦物，其分子式為Ca5(PO4)3(OH)，主要存在于脊椎動物的骨、牙齒等硬組織中。HAP屬六方晶系，其結構為六角柱體，具有較好的穩定性。但是其本身容易團聚形成較大的晶體，使得其生物學性能下降[5]。合成納米級HAP，使其具有較大的比表面積，并且其生物相容性和生物活性均優于醫用鈦、硅及碳材料等植入醫用材料，可作為一種骨骼或牙齒的誘導因子，應用于硬組織修復及骨填充[6]。此外，nHAP對DNA和蛋白質具有高親和力，常用于蛋白質層析實驗[7]。

2.nHAP制備方法：nHAP的制備方法眾多，主要分為干法和濕法兩類[8]。干法合成相對較少，主要采用固相法；濕法合成主要包括：水熱合成法、化學沉淀法、微乳液法等。其中nHAP較為普遍的制備方法是水熱合成法和化學沉淀法。水熱合成法比較環保且成本較低，但對設備要求較高，需要耐高溫、高壓的密閉容器。該方法通常采用Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4作為原料，在一定的pH值和較高的溫度與壓力的條件，鈣鹽和磷酸鹽在水溶液中反應將合成nHAP，并可通過控制水熱條件得到不同的納米晶體物相。

化學沉淀法因其實驗條件簡單、成本較低，是合成納米材料常用的方法之一。將不同的含Ca和P的化合物在水溶液中發生沉淀反應，即可得到HA，但其顆粒尺寸分布范圍廣且顆粒分散度低。在此基礎上使用添加劑改性或冷凍干燥可減小顆粒尺寸及改善顆粒分散度，得到nHAP。

二、nHAP對腫瘤細胞超微結構和功能的影響

Han等[9]研究了nHAP對正常和腫瘤細胞生長的不同抑制作用及其機制。將nHAP直接注入裸鼠移植瘤中，可使腫瘤體積縮小50%以上，感染裸鼠的存活時間也明顯增長。研究表明，nHAP的抗腫瘤作用主要是通過抑制細胞內蛋白質合成來實現的。由于其對核糖體的高親和力，降低了mRNA與核糖體的結合，從而抑制蛋白質的合成，影響細胞增殖[10]。此外，相較其他納米材料，nHAP具有細胞毒性低的優點[11]。如碳納米管和金屬氧化物納米材料可以從其表面釋放活性氧(ROS)，從而促進細胞死亡，然而這種療法在殺傷癌細胞的同時對于正常細胞也有相同毒性。Han等[12]研究顯示，負責活性氧產生和清除的關鍵酶琥珀酸脫氫酶和超氧化物歧化酶的活性在nHAP處理后顯著降低，因此nHAP對于正常細胞殺傷作用小，有望為癌癥治療提供安全有效的替代方案。

在nHAP的體外實驗中，Yin等[13]研究了以Bel-7402肝癌細胞作為單細胞懸液與nHAP的相互作用。其通過倒置顯微鏡觀察到，nHAP處理Bel-7402單細胞懸液24h后，Bel-7402細胞在培養基中仍呈均勻分布，無細胞貼壁。相反，對照組的細胞都已黏附。這一結果表明，隨著腫瘤細胞唾液酸殘基對其表面糖蛋白酸化程度的增加，其表面的負電荷也隨之增加，使表面帶正電荷的nHAP更容易吸附腫瘤細胞。nHAP包被Bel-7402細胞可顯著影響其細胞膜的功能，從而減少Bel-7402細胞的黏附。

單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)基因可通過阻斷DNA合成導致細胞死亡[14]，又稱“自殺”基因治療，在多種腫瘤模型中均有效。然而缺乏安全高效的基因遞送系統已成為“自殺”基因治療的一大障礙。Cheang等[15]制備了氧化石墨烯-羥基磷灰石(graphene oxide-hydroxyapatite，GO-nHAP)復合體作為載體將HSV-TK基因導入乳腺細胞，并采用流式細胞儀檢測GO-nHAP復合體的轉染效率和細胞毒性。研究表明，nHAP與DNA結合可保護DNA不受核酸酶的自發降解，同時石墨烯的摻入使nHAP的比表面積大幅增加，為DNA提供了大量的結合位點。此外，GO-nHAP復合體對正常乳腺細胞的細胞毒作用尚可耐受，且具有高度穩定性。因此GO-nHAP復合體可作為一種新型高效的腫瘤治療基因載體。

nHAP除被用作藥物、蛋白質和基因傳遞的載體，還對腫瘤細胞具有細胞毒性作用。Sun等[16]比較了nHAP對肺癌細胞(A549)和正常支氣管上皮細胞(16HBE)的細胞毒性作用。在A549細胞中，nHAP可有效靶向線粒體，導致線粒體膜電位降低，caspase-3和caspase-9酶活性升高，從而誘導線粒體介導的細胞凋亡。此外，nHAP引起腫瘤細胞內鈣離子濃度持續升高，而正常對照組細胞內鈣離子濃度僅有一過性升高。其原因可能是nHAP在含有多種水解酶的內體中迅速降解，從而引起細胞鈣超載，導致細胞壞死、凋亡或自噬。nHAP的線粒體靶向性增強以及A549細胞內鈣離子濃度的持續升高，導致nHAP的腫瘤特異性細胞毒性作用。

Nasser等[17]制備了nHAP/MgO復合體并測試其抗癌活性。研究發現，MgO具有雙層疏水外膜，其疏水特征與細胞膜類似，使細胞易于通過內吞作用攝取MgO。nHAP在胞內通過誘導腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)產生從而激活凋亡途徑，使腫瘤細胞壞死。磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)染色結果表明，由介孔氧化鎂作為載體包裹nHAP形成的復合體，其抗癌活性比單獨使用MgO和nHAP提高了3倍，nHAP/MgO復合體作為靶向腫瘤組織和細胞的藥物顯示出良好的潛力。

三、nHAP形成礦化膠原纖維防止腫瘤侵襲

骨是多發性骨髓瘤、前列腺癌及乳腺癌等癌癥轉移的首選部位。轉移性癌細胞與骨細胞相互作用，促進癌細胞擴增，同時破壞體內骨重建平衡。nHAP作為骨細胞外基質的重要成分在癌細胞黏附和遷移中發揮重要作用。因此了解骨細胞外基質與骨轉移癌細胞之間的相互作用對于調控和預防骨轉移癌細胞生長是必要的[18]。

He等[19]通過X射線散射和拉曼成像在小鼠乳腺癌模型中表征nHAP結構。研究表明，容易發生腫瘤細胞轉移的骨骼部位包含較不成熟的nHAP，并且在繼發腫瘤形成前，原發腫瘤可以進一步促進nHAP不成熟化。這是由于乳腺腫瘤可以通過刺激成骨細胞增加其新骨生成或分泌可溶性因子從而直接抑制骨礦物質的生理性成熟。Choi等[20]通過聚合物誘導的液體前驅體(polymer-induced liquid-precursor，PILP)技術在體外促進膠原的纖維內礦化，并促進成熟nHAP晶體的形成，隨后采用掃描電子顯微鏡觀察礦化膠原對腫瘤細胞黏附及侵襲能力的影響。結果表明膠原纖維的生理性礦化可減少腫瘤細胞的黏附，經細胞核和絲狀肌動蛋白(filamentous actin, F-actin)染色的細胞的共聚焦圖像分析證實，與礦化膠原相互作用的乳腺癌細胞擴散及侵襲均顯著降低[21]。

Ahn等[22]使用nHAP和纖維蛋白的三維仿骨復合材料模擬骨的微環境，來研究腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)和nHAP之間的相互作用，建立了胃癌細胞(MKN74)的TME骨轉移模型。其通過F-actin染色檢測細胞增殖并分析細胞形態。結果顯示，MKN74細胞在較高的nHAP濃度下表現出顯著的遷移減少和胞質體積減小，表明nHAP對癌細胞的轉移和增殖具有抑制作用。此外，nHAP同時具有顯著抑制腫瘤相關的血管生成的功能，從而阻斷了腫瘤生長、轉移、代謝的營養需求，起到抑制腫瘤生長及轉移的目的。

大多數研究將促進骨中轉移性腫瘤的形成歸因于生長因子和其他可溶性信號的釋放。Siddharth等[23]研究證明，骨轉移的惡性潛能不僅由骨微環境中的生長因子介導，而且還受到nHAP材料特性的影響，通過溶液沉淀反應、水熱合成法制備出粒徑分布和結晶度均不同的nHAP，并在含血清的培養基中孵育。經比色法測定，與較大、結晶較多的nHAP比較，較小、結晶較少的nHAP吸附了更多的血清蛋白。蛋白質吸附的改變將影響纖維連接蛋白等生物分子調節細胞附著、局部黏附形成和增殖信號通路，從而影響乳腺腫瘤細胞的黏附和生長。因此，調控腫瘤患者骨組織局部nHAP的晶體結構及比表面積等理化特性，可能通過阻斷蛋白吸附作用，來抑制侵襲的腫瘤細胞的黏附和生長，從而阻斷其高親和力，抑制腫瘤的侵襲和增殖潛能。

四、nHAP促進腫瘤細胞轉移

盡管上述研究展示出nHAP良好的抗腫瘤生長及轉移效果，但亦有研究顯示nHAP可促進腫瘤細胞轉移。Pathi等[24]開發了一種礦化三維腫瘤模型，利用該培養系統在體外研究了nHAP在病理相關條件下的促轉移作用。與非礦化腫瘤模型比較，礦化腫瘤模型中腫瘤細胞黏附、增殖現象顯著增加。這一結果表明，nHAP促進了癌細胞的增殖及骨轉移，白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)可能在這一過程中發揮重要作用。IL-8具有促血管及破骨細胞生成的作用，可導致病理性骨吸收，加劇骨形成與吸收的失衡，從而進一步刺激轉移性腫瘤生長。而nHAP介導的αvβ3整合素可使IL-8分泌增加，促進繼發性腫瘤生長和骨破壞。整合素是控制細胞內信號通路的細胞黏附受體，可以調節癌細胞的轉移表型。研究結果表明，癌細胞具有高水平的磷酸化形式的細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，其作為整合素介導的信號轉導的關鍵，可以刺激IL-8等趨化因子的表達。這一研究為骨微環境中的礦物質基質調節腫瘤骨轉移相關的病理性骨重建提供了分子機制。

導管原位癌(ductal carcinoma in situ, DCIS)是大多數浸潤性乳腺癌(invasive breast carcinomas, IBC)的癌前病變。DCIS的典型診斷是通過乳房X光檢查微鈣化(microcalcifications, MC)現象，即微鈣化點越多，提示DCIS惡性程度越高。而與惡性乳腺病變相關的微鈣化主要由nHAP和相關的磷酸鈣礦物組成。Frank等[25]在空白對照及含有HA的聚丙交酯-乙交酯(poly lactide-co-glycolide, PLG)支架中分別培養乳腺癌細胞，評價nHAP對惡性腫瘤進展的影響。在HA支架中培養的DCIS細胞發生了與侵襲性增加相關的變化，如增殖失調、失去細胞間的接觸及細胞的運動性增加。結果表明，nHAP可以刺激癌前DCIS細胞表現侵襲性，其機制可能依賴于IL-8信號轉導。其通過DNA分析來測定細胞生長，并用實時定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)測定IL-8基因的表達，觀察到nHAP在正常和DCIS細胞系中有抑制增殖作用，但在IBC細胞系中無此作用；相反，nHAP在DCIS和IBC細胞系中上調IL-8基因表達和可溶性因子分泌，但在正常細胞中不上調。這一數據表明，nHAP會導致乳腺癌細胞的增殖和IL-8分泌上調，促進其惡性程度。此外，在nHAP支架中培養的DCIS細胞，其間充質形狀發生改變并且細胞間的接觸減少，表現出更強的運動性。綜上所述，nHAP在一定情況下存在促進腫瘤惡變，并增強其侵襲性的風險，主要可能與腫瘤局部區域nHAP的晶體結構及比表面積等理化特性相關[22]。

五、展 望

nHAP通過改變腫瘤細胞超微結構和功能，可有效抑制癌細胞的增殖并減少其黏附作用。同時其對于正常細胞和癌細胞具有不同作用機制，表現出無毒性的優點。此外，nHAP還可以礦化腫瘤組織局部膠原纖維，抑制腫瘤轉移及侵襲，提高患者生存率。綜上所述，nHAP與癌細胞及膠原纖維相互作用分子機制的發現為轉移性腫瘤的治療開辟了新的應用前景。然而，需要注意的是，nHAP亦可在特定環境中促進生長因子和其他可溶性信號的釋放，從而增強腫瘤惡性潛能，并刺激其發生增殖和黏附，這可能受到nHAP晶體結構及比表面積等理化特性的調控。因此，仍需通過技術手段進一步探究nHAP理化特性與腫瘤微環境之間的相互作用機制，以推進nHAP在轉移性腫瘤預防及治療領域中的作用。