流式細胞術檢測急性白血病微小殘留病的應用價值

曹 琳 宋鏡南

信陽職業技術學院，河南省信陽市 464000

急性白血病(AL)是發生在造血干細胞水平上的惡性腫瘤，按照其分化的系別不同，分為急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)兩大類[1]。AL 診斷時體內白血病細胞總數約1012，誘導化療達到完全緩解后，白血病細胞總數 <109，這種體內殘存的少量白血病細胞稱為白血病微小殘留病(MRD)。AL在現有治療技術下完全緩解率明顯增加，但仍有一些患者出現復發的情況[1]。治療過程中的定期監測有助于對化療敏感度及整體治療情況的評估。既往常通過對骨髓細胞的形態學觀察評估病情，然而這種方法的敏感性和特異性均有限，可能會由于對殘留疾病的錯誤評估而出現過度治療或治療不足的情況。因此，需要更準確和特異的方法來檢測殘留白血病細胞。

1 流式細胞術檢測MRD的優勢

檢測殘存白血病細胞，需要在患者發病時找到該患者白血病細胞的特異標志，包括遺傳學、分子學及免疫學的特征。這些特征往往是正常血細胞所沒有的，因此利用這些標志可與正常細胞進行鑒別，特異地識別白血病細胞。

1.1 熒光原位雜交技術(FISH) FISH使用染色體或基因特異核酸探針檢測染色體數目或結構的異常，可對特異的 DNA 序列進行分析。但該方法僅適于部分具有特殊遺傳學特征的白血病細胞，靈敏度僅為 10-2～10-3。FISH方法雖可明確初診時白血病細胞染色體數量或結構上的改變，但敏感性較低，檢測結果受分裂相多少的影響。若與其他技術結合亦可提高其靈敏度[2]。Wang等[3]將流式細胞術與FISH結合，對AML患者先利用流式細胞儀篩選出CD34+CD38-細胞，再對分選細胞進行FISH，熒光顯微鏡下分析FISH+CD34+CD38-細胞(白血病干細胞)的比例，此方法富集白血病細胞后再應用FISH檢測MRD，可提高白血病細胞的檢出率。

1.2 聚合酶鏈式反應(PCR) PCR技術通過在體外大量擴增特定的DNA片段，再對擴增后片段進行檢測。應用 PCR檢測ALL 患者 MRD 時，常采用免疫球蛋白(Ig)和/或 T 細胞受體(TCR)基因重排序列作為標志。ALL 白血病細胞起源于單個早期病變淋巴細胞，大多數具有克隆性 Ig 基因和/或 TCR 基因重排，因此可通過IgH、IgK、TCRαβ、γδ等標志物檢測MRD。約 90% 的ALL 兒童患者的MRD可通過重排基因進行檢測，該方法敏感性達10-4[4]。實時熒光定量PCR(RQ-PCR)通過實時測定PCR產物上的熒光物質，可實時檢測PCR產物，靈敏度可達到10-6，是目前檢測MRD靈敏度最高的方法。RQ-PCR可對含有融合基因(PML/RARa、AML1/ETO、CBFβ/MYH11)、突變基因(FLT3、NPMl)和異常表達基因(WT1)的白血病亞型進行 MRD 檢測，通過對異常基因檢測的高度敏感性，可將白血病細胞與正常細胞區分。但是僅有約 40% ALL和30%的AML具有異常的分子生物學標記[5]，對其余多數無分子生物學異常標記的患者并不適用。而對于具有異常分子標記的AL中，由于PCR產物的數量與白血病細胞數量之間沒有明確的比例關系，因此只能對殘存的白血病細胞進行定性監測，無法做出精確評估。此外，白血病細胞的分子標記的不穩定性也為檢測增加了難度。在白血病治療或復發過程中，分子標記可能發生變化，使PCR技術出現漏檢，不僅增加了結果的假陰性率，也需要探索新的分子標記[2]。

1.3 流式細胞術(FCM) FCM檢測急性白血病微小殘留病是利用白血病細胞上白血病相關的免疫表型(LAIP)的表達與正常細胞的區別，從而成為區分白血病細胞和正常細胞的一種技術方法，可對檢測的細胞進行快速多參數的定量分析，靈敏度達10-4～10-5[6]。多色 FCM 是檢測 ALL-MRD 的方法之一，可從104或更多正常細胞中檢測出1個白血病細胞， 3、4種熒光FCM 的引進增加了FCM檢測的靈敏度和適用范圍[7]。目前已擴展到6～9色標記，多色標記可以提供LAIP的多項指標，降低了識別難度，大大提高了 MRD 檢測的靈敏度、準確度及適用性[4]。FCM可對LAIP進行檢測，不受分子生物學異常的影響，對殘留白血病細胞進行準確定量，比PCR技術更直觀，應用更廣泛[8]，現已成為檢測 MRD 最有前景的一種方法。

2 FCM對MRD的免疫學檢測

隨著多色熒光的使用，FCM對MRD的檢測更快速準確。但早期由于對細胞單克隆抗體標記物的認識較少，限制了MRD的免疫學研究發展。例如TdT和CD10不僅在大多數淋巴母細胞瘤細胞中表達，也可出現在正常前體B細胞中。因此不能使用TdT和CD10對骨髓中的異常細胞進行甄別[9]。然而白血病細胞上的LAIP與正常細胞具有明顯的差異，可據此區分出白血病細胞。LAIP主要包括表達跨系列或交叉系列抗原標志、跨期或不同期的抗原共表達、抗原表達量的異常、散射光異常等4種類型。例如，在一些B-ALL和AML中可表達CD34/CD19/CD20和CD34/CD56，這些免疫表型組合在正常細胞中極少表達。CD3/TdT除了在胸腺中發育的T細胞有所表達外，在其他正常造血細胞中幾乎無表達，因此可將CD3/TdT作為判斷T-ALL的一項參考指標。

目前，FCM診斷MRD的方法主要有兩種[7，10]，第一種是在初發時確定急性白血病的類型，篩選出LAIP，并在緩解后以該LAIP監測殘留的白血病細胞。在此方法中，緩解后陽性細胞的量與在診斷時檢測量的比較對于臨床診斷及預后判斷有重要的價值。另一種方法是先根據正常骨髓標本抗原表達情況建立陰性的雙軸點圖，若抗原出現在陽性區域范圍內即可反映其異常表達。正常的骨髓細胞和白血病細胞若顯示表達相似的免疫抗原，可以通過它們的數量差異來區分。例如在一些B-ALL病例中，在CD19陽性的細胞中可出現CD10和CD34的過表達、CD45和CD38的失表達[11]。

2.1 T-ALL 幾乎所有的T-ALL均表達TdT和泛T標志(CD2、核質CD3、CD5、CD7)等。CD34抗原在T-ALL陽性比例在30%左右，可用于TdT表達較弱或陰性的病例。通過使用CD19和MHC-Ⅱ標記，可以進一步增強T-ALL細胞的檢測，這些標記在大多數正常骨髓TdT+細胞上都有較強的陽性表達，但在T-ALL細胞上的表達為陰性。

2.2 B-ALL B-ALL的MRD檢測較為復雜，需要使用較多的抗體組合。CD19、CD10、CD34或TdT的同時表達通常用于識別不成熟的B細胞。在近30%的病例中，抗原表達的數量差異也可用于區分白血病細胞和正常細胞。CD38、CD45和CD22在正常的未成熟B細胞和白血病細胞中均有不同量表達，也可通過對髓系和NK相關分子的抗體檢測到區分正常細胞和白血病細胞。結合以上這些免疫表型可以檢測高達85%的B-ALL，敏感度達到10-4[12]。

2.3 AML 據報道[13]，約2/3以上的AML病例發現免疫表型的表達異常，但這些異常的免疫表型在MRD檢測中的敏感性尚不清楚。CD34/CD56這兩種免疫抗原在近20%的兒童AML中同時表達，且與t(8;21)(q22;q22)相關，且此組合的靈敏度可以達到10-4，是目前較為適合MRD檢測的抗原組合。由于70%～80%的AML患者表達CD87，而在正常CD34+細胞中僅表達0.2%，因此CD34和CD87是另一種可能有用的組合[14]。

3 總結和展望

近期前瞻性研究報道[15]，MRD的評估是影響兒童期ALL治療結果的獨立預后因素。治療早期MRD的檢測對疾病的預后有預測價值。因此在西方國家，幾乎所有的兒童ALL患者和大部分成年ALL患者都會進行MRD監測用于區分不同的危險度和評估治療效果[12]。隨著多色流式細胞儀的發展，FCM 檢測 MRD的準確性和靈敏度均有很大的提升。FCM的應用范圍廣，但其結果會受到設門方式、抗體組合、操作者技術水平等多方面的影響，不同實驗室之間檢測結果有差異，且缺乏統一標準。目前白血病治療已經進入MRD時代，MRD檢測的重要性已經得到充分的證實，因此在今后的臨床研究中，MRD檢測將對白血病的治療和預后判斷有著重要的意義，也將成為FCM在血液學應用的重要部分。