神經毒素誘導帕金森病動物模型的研究進展

孫 雪 梁建慶 何建成 馬利芳

帕金森病(parkinson disease，PD)是一種以靜止性震顫、肌強直、運動減少及體位障礙為主要臨床表現的中樞神經系統退行性疾病。黑質-紋狀體多巴胺(dopamine，DA)能神經元的進行性丟失和胞質內路易小體(Lewy body) 的形成是PD主要病理改變[1]。目前，PD確切的病因病機尚未可知，而隨著PD發生率的不斷攀升，該領域的研究備受人們關注。論及PD的研究必離不開實驗動物模型的制備。PD的動物模型主要分為神經毒素模型和轉基因模型兩大類。神經毒素模型作為PD經典模型，主要針對DA信號模擬PD大部分病理和表型[2]。與基因模型比較，神經毒素動物模型病理機制更加清楚，造模方法更加完善。遺傳基因動物模型的制備不僅復雜耗時且極易產生不良反應[3,4]。各種動物模型的制備都是模擬PD部分病理改變，有其各自的優勢和局限性。本文針對國內外PD神經毒素實驗動物的制備方法及相關原理進行綜述，以期能進一步了解PD病理過程，為科研實驗提供最優方案。

一、6-羥基多巴胺損傷動物模型

6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)是特異性的兒茶酚胺能神經毒素。6-OHDA雖受血-腦脊液屏障阻擋，但其對DA質膜轉運蛋白具有高親和力，可通過觸發氧化應激相關細胞毒性和小膠質細胞依賴性DA神經元炎癥，發揮毒性作用[5]。

1.作用機制：目前6-OHDA神經毒素作用的確切機制并未完全明了，已有研究表明6-OHDA的機制與氧化應激和抑制線粒體呼吸鏈有關。6-OHDA可與DA轉運體結合進入黑質紋狀體DA能神經元，經過多重氧化，最終損傷細胞。6-OHDA還可通過抑制線粒體呼吸酶復合體，阻斷電子傳遞鏈，增加氧化應激，導致線粒體呼吸鏈被抑制，最終細胞內ATP耗盡引起細胞死亡[6,7]。

2.6-OHDA損傷動物模型：6-OHDA因受血-腦脊液屏障阻礙，造模需要腦內注射。腦內注射為立體定向注射，注射部位多為黑質致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)、紋狀體(corpora striate，CS)、中腦腹側被蓋區(ventraltegmental area，VTA)、前腦內側束(medial forebrainbundle，MFB)，通常采用單點或雙點注射法來制備單側或雙側損毀的PD模型[8]。6-OHDA的劑量、濃度及損毀位點的選擇都會影響PD模型的最終呈現。

3.6-OHDA損傷動物模型優劣性：6-OHDA的單側損毀方法成熟簡單，存活率高，模型評價方法簡便。模型動物腹腔注射阿樸嗎啡(或苯丙胺)不自主的向健側(或傷側)旋轉運動行為可評估6-OHDA對黑質DN損傷程度。單點注射常用方法主要包含SNc、CS、VTA、MFB位點的注射，這些方法各有優缺點。SNc的單點注射可以根據6-OHDA注入內部劑量的多少，而相應制作出急性完全和部分損傷的模型。這種方法的劣勢為SNc的范圍小，定位困難，成功率較低，且難以區分最后的結果是毒性損傷還是機械損傷造成[9]。CS分布廣，易定位，DA能神經元末梢吸收6-OHDA后，發生逆行性變性，從而破壞中腦黑質DA能神經元[10]。VTA是制備PD模型的重要靶點，注入后可增加大鼠模型旋轉強度，方法簡單易成功，但與人類PD病理特征不相符[11]。MFB的位置較深，定位困難，易發生變異，成功率較低。MFB多點注射可以提高造模的成功率，縮短周期，廣泛的浸潤損傷可以大量破壞DA能神經元，模擬出中晚期癥狀。此方法雖然提高了模型的穩定性和成功率，但其損傷重并不完全符合發病機制。6-OHDA的注射劑量決定模型DA紋狀體通路病變及紋狀體DA的顯著下降程度[12]。綜上所述，6-OHDA模型的優勢主要表現在絕佳的評估方法上，通過一側損毀，出現對側行為癥狀來評斷模型成功與否。其劣勢為病死率較高，不能完全模擬PD的發病機制。

二、1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶動物模型

1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(1-methy l-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydoyndine,MPTP)是一種本身沒有毒性的脂溶性有機化合物，其能通過血-腦脊液屏障。MPTP在大腦中代謝產生有毒物質1-甲基-4-苯基呲啶離子(MPP+)，引起毒性機制。

1.作用機制：MPTP作為高親脂性化合物，能有效地透過血-腦脊液屏障。在腦內，先是被細胞線粒體外膜的單胺氧化酶B(MAO-B)催化變成中間代謝產物1-甲基-4苯基-2,3-二氫呲啶離子(MPDP+)，后自發氧化成毒性的MPP+。MPP+的結構與DA類似，能夠與多巴胺能轉運體(DAT)高度親和，被紋狀體內多巴胺能(DAG)神經元軸突末梢突觸前膜的DAT運載進入胞體內[13,14]。

2.MPTP動物模型優劣性：MPTP的PD動物模型會因不同的給藥方式、給藥時間呈現出不同的病理特征。MPTP動物模型通常采用腹腔內注射、皮下注射、靜脈注射的方式制備。這種給藥方法操作相對簡便易行，模型代表性好，成功率也高。目前MPTP最常用的PD動物是小鼠動物模型，因其病理生理機制與PD吻合度較高，備受青睞。各種PD小鼠模型根據注射劑量、間隔時間、方式以及時間長短的不同來制備不同研究目的模型，主要分為急性模型、亞急性模型和慢性模型[15]。急性模型是采用腹腔或皮下注射，間隔時間短，建模速度快，損傷嚴重，但其模型并不符合PD慢性發病的特點，并且這種建模方法并非神經元慢性凋亡而是快速損傷壞死，病死率相對較高。亞急性模型同樣也采用腹腔注射或皮下注射的方式，間隔時間較急性長，建模速度一般，成活率較高，損傷比急性輕，并且具有PD一定的發病特點，DAG神經元有部分凋亡。亞急性模型的缺點是損傷時間比急性模型長，病理機制與PD患者慢性發病機制差別比較大，其損傷的DAG神經元有部分凋亡的同時還有大量壞死[16]。經目前研究表明，不管是急性還是亞急性，都只是一個短暫的對于黑質-紋狀體神經元容易發生逆轉的神經毒性作用，這種快速的方法無法與緩慢、漸進性的PD相匹配[17]。慢性模型除了給藥時間間隔長，其病死率非常低，癥狀典型穩定，且病理損傷過程穩固不易恢復，與PD的病理生理過程相符合。綜上所述，不管哪種MPTP方案都只能是部分模擬PD的病理機制，完全模擬PD的運動障礙仍存在困難。

三、魚藤酮動物模型

魚藤酮是屬異黃酮家族的一種植物性殺蟲劑。研究表明，用魚藤酮染毒可誘發動物出現運動遲緩、僵直、震顫等類似PD的典型臨床癥狀；用魚藤染毒小鼠在黑質紋狀體的細胞中也可出現α突觸蛋白(α-synuclein) 聚集和DA神經元的丟失現象[18]。

1.作用機制：目前關于魚藤酮導致PD的發病機制還不是十分清晰，尚認為其可能主要從細胞凋亡、細胞自噬、神經炎性反應方面導致PD的發生[19]。魚藤酮的脂溶性，可通過血-腦脊液屏障及生物膜，繼而選擇性地與線粒體復合物Ⅰ結合，破壞氧化磷酸化，誘發氧化應激，從而發揮細胞毒性作用。

2.魚藤酮動物模型優劣性：魚藤酮PD大鼠動物模型最大的優勢為PD模型行為學改變和病理學特征均與臨床PD相似。魚藤酮模型的慢性暴露方式在病理、生化等各方面均能較好地模擬PD相關特征[20]。但魚藤酮的全身毒性致使PD動物模型存在成模率低、成本高、方法復雜等缺點。魚藤酮模型給藥方式較多，優劣各異。腦立體定位給藥的造模方法較難，需定位準確，但其病死率低，成功率高。靜脈給藥方式的存活率相對其他大劑量的存活率高，方法簡單，藥物直接進入全身循環，但全身毒性大。腹腔注射造模，吸收面積大，成模率高，操作簡便，不僅癥狀與PD患者相似，且能制備PD的胃腸功能障礙模型[21]。皮下注射的方式更為便捷，成本低，成模率高，但皮下注射會引起大鼠全身毒性，導致較高病死率，且不符合PD病變特點?？诜炷７螾D慢性進行性病程，還避免了外周毒性，該方式病死率低，成模率高，適于研究PD病機病程變化及治療藥物的作用機制。魚藤酮動物模型更符合PD病理進程，黑質-紋狀體通路及腸道神經元均出現路易小體，其明顯的劣勢為動物病死率過高。由此可見，對于選擇魚藤酮造模方法要根據實際操作進一步選擇。

四、百草枯動物模型

百草枯(paraquat，PQ)是一種與MPP+結構相似，與MPTP神經毒性相似的快速滅生性除草劑。百草枯機制尚不明確，但其可通過血-腦脊液屏障到達黑質紋狀體系統，選擇性地破壞黑質致密部DA能神經元，最終產生類似于PD的癥狀[22]。

1.作用機制：百草枯是PD病因的外源性神經毒素，長期低劑量暴露于百草枯會造成DA能神經易損。PQ的神經毒性機制尚不明確，但就目前研究認為可能是：①激活星形膠質細胞合成和釋放致炎細胞因子：細胞外基質降解加速神經元損傷及毛細血管基膜膠原成分降解破壞血-腦脊液屏障增加通透性，最終腦損害加重；②氧化應激：自由基作用形成過氧化物，對DNA和蛋白質產生氧化損傷；③抑制線粒體功能。黑質和紋狀體中線粒體功能障礙，致使細胞凋亡加速加重，黑質區TH神經元數目減少，甚至腦組織有壞死空腔形成。

2.百草枯動物模型的優劣性：百草枯動物模型的制備主要是模擬了人類暴露于百草枯的方式。這種方法更符合環境因素誘發的PD患者。商用百草枯水劑成本低，實驗周期長，符合PD慢性進程的特點。這種模型制備方式若單純使用百草枯造模會導致小鼠病死率增高，同時加上抗纖維化的藥物會使模型更易制備。但部分實驗用百草枯造模時并未提及它致死率的高低，以及造模時是否有必要給予抗纖維化的藥物用以預防其毒性不良反應的發生，其科學性與可行性有待討論[23]。腹腔、腦內或皮下注射以及口服百草枯的方法均可制備百草枯PD模型。單次或短期較高劑量多次注射百草枯可誘導出神經元壞死的模型，但這種方式與長期暴露于百草枯的致病方式相悖，且這種百草枯試劑價格昂貴。腦內注射需借助腦立體定位儀，模型成功率較低，過程復雜，有一定技術難度。口服百草枯的制備方式更加符合人類的主要經口暴露方式，但這種方式建立PD模型的研究國內報道較為罕見。而口服百草枯造模和腹腔注射百草枯造模兩者間比較, 腹腔注射造模效果更好，行為學改變更為顯著。所以運用百草枯動物模型的具體方法要根據實際試驗操作慎重選擇。

五、展 望

4種神經毒素誘導的PD動物模型各有所長。不同的造模方法、給藥方式及劑量均會影響模型作用機制與實驗結果，建立一個穩定、成功率高、簡便易行的模型是構建PD模型亟待解決的問題。目前PD的致病因素和發病機制尚不明確，但基因突變、環境等多種致病因素與PD密切相關。神經毒性藥物模型在PD的相關研究中具有廣闊前景，但現在所掌握的模型制備方法都沒有PD明顯的病理改變，僅有局限的生化反應，想要模擬出完備的PD動物模型仍需要進一步探討研究。相信在未來，PD動物模型能完全符合PD這一神經系統的慢性疾病的自然進程。隨著PD“基因時代”的來臨，基因模型尚未被證實是否復制了PD的大部分主要特征，但神經毒素和基因模型的結合對于挖掘人類PD機制與治療不可或缺，值得深入探討。